La secuenciación masiva de firmas paralelas ( MPSS ) es un procedimiento que se utiliza para identificar y cuantificar transcripciones de ARNm , lo que produce datos similares al análisis en serie de la expresión genética (SAGE), aunque emplea una serie de pasos bioquímicos y de secuenciación que son sustancialmente diferentes.
El MPSS es un método para determinar los niveles de expresión del ARNm mediante el recuento del número de moléculas individuales de ARNm producidas por cada gen. Es un método "abierto" en el sentido de que la identidad de los ARN que se van a medir no está predeterminada, como ocurre con los microarrays de expresión génica .
Una muestra de ARNm se convierte primero en ADN complementario ( ADNc ) utilizando la transcriptasa inversa , lo que facilita las manipulaciones posteriores. Estos ADNc se fusionan a una pequeña "etiqueta" de oligonucleótidos que permite que el ADNc se amplifique por PCR y luego se acople a microesferas. Después de varias rondas de determinación de secuencia, utilizando la hibridación de sondas marcadas con fluorescencia, se determina una firma de secuencia de ~16–20 pb de cada microesfera. La imagen fluorescente captura la señal de todas las microesferas, mientras están fijadas a una superficie bidimensional, por lo que las secuencias de ADN se determinan a partir de todas las microesferas en paralelo. Hay cierta amplificación del material de partida, por lo que, al final, se obtienen aproximadamente 1.000.000 de lecturas de secuencia por experimento. [1]
El MPSS permite identificar las transcripciones de ARNm mediante la generación de una secuencia distintiva de 17 a 20 pb ( par de bases ) adyacente al extremo 3' del sitio más 3' de la enzima de restricción designada (comúnmente Sau3A o DpnII ). Cada secuencia distintiva se clona en una de un millón de microperlas . La técnica garantiza que solo un tipo de secuencia de ADN esté en una microperla. Entonces, si hay 50 copias de una transcripción específica en la muestra biológica, estas transcripciones se capturarán en 50 microperlas diferentes, cada perla conteniendo aproximadamente 100.000 copias amplificadas de la secuencia distintiva específica. Luego, las microperlas se colocan en una celda de flujo para secuenciación y cuantificación. Las firmas de secuencia se descifran mediante la identificación paralela de cuatro bases por hibridación con codificadores marcados con fluorescencia (Figura 5). Cada uno de los codificadores tiene una etiqueta única que se detecta después de la hibridación tomando una imagen de la matriz de microperlas. El siguiente paso es cortar y eliminar ese conjunto de cuatro bases y revelar las siguientes cuatro bases para una nueva ronda de hibridación con codificadores y adquisición de imágenes. El resultado sin procesar es una lista de secuencias distintivas de 17 a 20 pb, que se pueden anotar en el genoma humano para la identificación de genes.
La secuencia de etiqueta más larga confiere una mayor especificidad que la etiqueta SAGE clásica de 9-10 pb . El nivel de expresión génica única está representado por el recuento de transcripciones presentes por millón de moléculas, similar al resultado de SAGE. Una ventaja significativa es el mayor tamaño de la biblioteca en comparación con SAGE. Una biblioteca MPSS normalmente contiene 1 millón de etiquetas de firma, que es aproximadamente 20 veces el tamaño de una biblioteca SAGE. Algunas de las desventajas relacionadas con SAGE también se aplican a MPSS, como la pérdida de ciertas transcripciones debido a la falta de sitio de reconocimiento de enzimas de restricción y la ambigüedad en la anotación de la etiqueta. La alta sensibilidad y la expresión génica absoluta ciertamente favorecen a MPSS. Sin embargo, la tecnología solo está disponible a través de Lynxgen Therapeutics, Inc. (luego Solexa Inc hasta 2006 y luego Illumina ).