Las proteínas SNARE – " SNA PRE ceptores" – son una gran familia de proteínas que consta de al menos 24 miembros en levaduras y más de 60 miembros en células de mamíferos y plantas . [2] [3] [4] La función principal de las proteínas SNARE es mediar la fusión de vesículas con la membrana diana ; esto media notablemente la exocitosis , pero también puede mediar la fusión de vesículas con compartimentos unidos a la membrana (como un lisosoma ). Las SNARE mejor estudiadas son aquellas que median la liberación de vesículas sinápticas que contienen neurotransmisores en neuronas . Estas SNARE neuronales son los objetivos de las neurotoxinas responsables del botulismo y el tétanos producidas por ciertas bacterias .
Las SNARE se pueden dividir en dos categorías: vesículas o v-SNARE , que se incorporan a las membranas de las vesículas de transporte durante la gemación, y diana o t-SNARE , que se asocian con las membranas de las terminales nerviosas. La evidencia sugiere que las t-SNARE forman subcomplejos estables que sirven como guías para las v-SNARE, incorporadas a la membrana de una vesícula recubierta de proteína, que se unen para completar la formación del complejo SNARE. [5] Varias proteínas SNARE se encuentran tanto en las vesículas como en las membranas diana, por lo tanto, un esquema de clasificación más reciente tiene en cuenta las características estructurales de las SNARE, dividiéndolas en R-SNARE y Q-SNARE. A menudo, las R-SNARE actúan como v-SNARE y las Q-SNARE actúan como t-SNARE. Las R-SNARE son proteínas que contribuyen con un residuo de arginina (R) en la formación de la capa iónica cero en el complejo SNARE central ensamblado. Una R-SNARE particular es la sinaptobrevina, que se encuentra en las vesículas sinápticas. Las Q-SNARE son proteínas que aportan un residuo de glutamina (Q) en la formación de la capa iónica cero en el complejo SNARE central ensamblado. Las Q-SNARE incluyen sintaxina y SNAP-25. Las Q-SNARE se clasifican además como Qa, Qb o Qc, según su ubicación en el haz de cuatro hélices.
Se conocen variantes de levaduras, [6] mamíferos, [2] [3] plantas, [4] Drosophila y Caenorhabditis elegans . [6]
Las SNARE son proteínas pequeñas, abundantes, a veces ancladas en la cola, que a menudo se insertan postraduccionalmente en las membranas a través de un dominio transmembrana C-terminal . Siete de las 38 SNARE conocidas, incluida SNAP-25 , no tienen un dominio transmembrana y, en cambio, se unen a la membrana a través de modificaciones lipídicas como la palmitoilación . [7] Las proteínas ancladas en la cola se pueden insertar en la membrana plasmática , el retículo endoplasmático , las mitocondrias y los peroxisomas , entre otras membranas, aunque cada SNARE en particular está dirigida a una membrana única. La orientación de las SNARE se logra alterando la composición de los residuos de aminoácidos flanqueantes C-terminales o la longitud del dominio transmembrana. El reemplazo del dominio transmembrana con anclajes lipídicos conduce a una etapa intermedia de fusión de membrana donde solo se fusionan los dos folíolos en contacto y no los dos folíolos distales de las dos bicapas de membrana. [8]
Aunque las SNARE varían considerablemente en estructura y tamaño, todas comparten un segmento en su dominio citosólico llamado motivo SNARE que consta de 60-70 aminoácidos y contiene repeticiones de heptada que tienen la capacidad de formar estructuras de hélice enrollada. Las SNARE V y t son capaces de ensamblarse de forma reversible en haces apretados de cuatro hélices llamados complejos "trans"-SNARE. En las vesículas sinápticas, los complejos "trans" metaestables que se forman fácilmente están compuestos de tres SNARE: sintaxina 1 y SNAP-25 residentes en la membrana celular y sinaptobrevina (también conocida como proteína de membrana asociada a vesículas o VAMP) anclada en la membrana de la vesícula.
En la exocitosis neuronal , la sintaxina y la sinaptobrevina están ancladas en sus respectivas membranas por sus dominios C-terminales, mientras que SNAP-25 está unido a la membrana plasmática a través de varias cadenas de palmitoilo unidas por cisteína. El complejo trans -SNARE central es un haz de cuatro hélices, donde una hélice es aportada por la sintaxina 1, una hélice por la sinaptobrevina y dos hélices son aportadas por SNAP-25. [9]
Se ha demostrado que las SNARE residentes en la membrana plasmática están presentes en microdominios o grupos distintos, cuya integridad es esencial para la competencia exocitótica de la célula.
Durante la fusión de membranas, las proteínas v-SNARE y t-SNARE de membranas separadas se combinan para formar un complejo trans-SNARE, también conocido como "SNAREpin". Según la etapa de fusión de las membranas, estos complejos pueden recibir diferentes nombres.
Durante la fusión de los complejos trans -SNARE, las membranas se fusionan y las proteínas SNARE involucradas en la formación del complejo después de la fusión se denominan entonces un complejo " cis "-SNARE, porque ahora residen en una única membrana resultante (o cis ). Después de la fusión, el complejo cis -SNARE se une y desmonta mediante una proteína adaptadora, alfa-SNAP . Luego, la ATPasa hexamérica (del tipo AAA ) llamada NSF cataliza el desdoblamiento dependiente de ATP de las proteínas SNARE y las libera en el citosol para su reciclaje.
Se cree que las SNARE son los componentes básicos necesarios de la maquinaria de fusión y pueden funcionar independientemente de otras proteínas accesorias citosólicas. Esto se demostró mediante la ingeniería de SNARE "invertidas", donde los dominios SNARE se orientan hacia el espacio extracelular en lugar de hacia el citosol. Cuando las células que contienen v-SNARE entran en contacto con células que contienen t-SNARE, se forman complejos trans -SNARE y se produce la fusión célula-célula. [10]
El complejo SNARE central es un haz de 4 hélices. [11] La sinaptobrevina y la sintaxina contribuyen con una hélice cada una, mientras que SNAP-25 participa con dos hélices (abreviadas como Sn1 y Sn2). Los residuos de aminoácidos que interactúan y que cierran el complejo SNARE se pueden agrupar en capas. Cada capa tiene 4 residuos de aminoácidos, un residuo por cada una de las 4 hélices. En el centro del complejo se encuentra la capa iónica cero compuesta por un residuo de arginina (R) y tres de glutamina (Q), y está flanqueada por cremalleras de leucina . Las capas '-1', '+1' y '+2' en el centro del complejo siguen más de cerca la geometría de cremallera de leucina y la composición de aminoácidos ideales. [12]
La capa iónica cero está compuesta por R56 de VAMP-2, Q226 de sintaxina-1A, Q53 de Sn1 y Q174 de Sn2, y está completamente enterrada dentro de las capas de cremallera de leucina. El grupo guanidino con carga positiva del residuo de arginina (R) interactúa con los grupos carboxilo de cada uno de los tres residuos de glutamina (Q).
Las capas de cremallera de leucina que las flanquean actúan como un sello hermético para proteger las interacciones iónicas del solvente circundante . La exposición de la capa iónica cero al solvente acuoso mediante la ruptura de la cremallera de leucina que las flanquea conduce a la inestabilidad del complejo SNARE y es el supuesto mecanismo por el cual -SNAP y NSF reciclan los complejos SNARE después de completarse la exocitosis de vesículas sinápticas .
Las proteínas SNARE deben ensamblarse en complejos trans -SNARE para proporcionar la fuerza necesaria para la fusión de vesículas . Los cuatro dominios de hélice α (1 de sinaptobrevina y sintaxina , y 2 de SNAP-25 ) se unen para formar un motivo de bobina superenrollada . El paso limitante de la velocidad en el proceso de ensamblaje es la asociación del dominio SNARE de la sintaxina, ya que generalmente se encuentra en un estado "cerrado" donde es incapaz de interactuar con otras proteínas SNARE. [13] Cuando la sintaxina está en un estado abierto, la formación del complejo trans -SNARE comienza con la asociación de los cuatro dominios SNARE en sus extremos N. Los dominios SNARE proceden a formar un motivo de bobina superenrollada en la dirección de los extremos C de sus respectivos dominios. SNAP y NSF también se asocian con el complejo formado por SNARE durante este paso y participan en los eventos posteriores de cebado y desmontaje.
Se cree que la proteína SM Munc18 desempeña un papel en el ensamblaje del complejo SNARE, aunque el mecanismo exacto por el que actúa aún está en debate. Se sabe que el broche de Munc18 bloquea la sintaxina en una conformación cerrada al unirse a sus dominios SNARE α-helicoidales , lo que impide que la sintaxina entre en los complejos SNARE (inhibiendo así la fusión ). [13] Sin embargo, el broche también es capaz de unir todo el haz de cuatro hélices del complejo trans -SNARE. Una hipótesis sugiere que, durante el ensamblaje del complejo SNARE, el broche de Munc18 libera la sintaxina cerrada, permanece asociada con el péptido N-terminal de la sintaxina (permitiendo la asociación del dominio SNARE de la sintaxina con otras proteínas SNARE) y luego se vuelve a unir al complejo SNARE de cuatro hélices recién formado. [14] Este posible mecanismo de disociación y posterior reasociación con los dominios SNARE podría depender del calcio. [15] Esto apoya la idea de que Munc18 juega un papel regulador clave en la fusión de vesículas ; en condiciones normales, Munc18 evitará la formación del complejo SNARE, pero cuando se activa, Munc18 realmente ayudará en el ensamblaje del complejo SNARE y, por lo tanto, actuará como un catalizador de fusión . [14]
La fusión de membranas es una serie de eventos que requieren un gran esfuerzo energético, que requiere la translocación de proteínas en la membrana y la ruptura de la bicapa lipídica, seguida de la reformación de una estructura de membrana muy curvada. El proceso de unión de dos membranas requiere energía de entrada para superar las fuerzas electrostáticas repulsivas entre las membranas. Se desconoce el mecanismo que regula el movimiento de las proteínas asociadas a la membrana fuera de la zona de contacto de la membrana antes de la fusión, pero se cree que el aumento local de la curvatura de la membrana contribuye al proceso. Las SNARE generan energía a través de interacciones proteína-lípido y proteína-proteína que actúan como fuerza impulsora para la fusión de membranas.
Un modelo plantea la hipótesis de que la fuerza necesaria para unir dos membranas durante la fusión proviene del cambio conformacional en los complejos trans -SNARE para formar complejos cis -SNARE. La hipótesis actual que describe este proceso se conoce como "cremallera" de SNARE. [16]
Cuando se forma el complejo trans -SNARE, las proteínas SNARE todavía se encuentran en membranas opuestas. A medida que los dominios SNARE continúan enrollándose en un proceso espontáneo , forman un haz de cuatro hélices mucho más apretado y estable. Durante este "cierre" del complejo SNARE, se cree que una fracción de la energía liberada de la unión se almacena como tensión de flexión molecular en los motivos SNARE individuales. Se postula que esta tensión mecánica se almacena en las regiones de enlace semirrígidas entre los dominios transmembrana y el haz helicoidal SNARE. [17] [18] La flexión energéticamente desfavorable se minimiza cuando el complejo se mueve periféricamente al sitio de fusión de la membrana. Como resultado, el alivio de la tensión supera las fuerzas repulsivas entre la vesícula y la membrana celular y presiona las dos membranas juntas. [19]
Se han propuesto varios modelos para explicar el paso posterior (la formación del tallo y el poro de fusión). Sin embargo, la naturaleza exacta de estos procesos sigue siendo objeto de debate. De acuerdo con la hipótesis de la "cremallera", a medida que se forma el complejo SNARE, el haz de hélices que se aprieta ejerce una fuerza de torsión sobre los dominios transmembrana (TM) de la sinaptobrevina y la sintaxina . [20] Esto hace que los dominios TM se inclinen dentro de las membranas separadas a medida que las proteínas se enrollan con más fuerza. La configuración inestable de los dominios TM finalmente hace que las dos membranas se fusionen y las proteínas SNARE se unan dentro de la misma membrana, lo que se conoce como un complejo " cis "-SNARE. [21] Como resultado de la reorganización de lípidos, se abre un poro de fusión y permite que el contenido químico de la vesícula se filtre al entorno exterior.
La explicación del continuo de la formación de los tallos sugiere que la fusión de membranas comienza con un radio infinitesimal hasta que se expande radialmente en una estructura similar a un tallo. Sin embargo, esta descripción no tiene en cuenta la dinámica molecular de los lípidos de membrana. Simulaciones moleculares recientes muestran que la proximidad de las membranas permite que los lípidos se expandan, donde una población de lípidos inserta sus colas hidrofóbicas en la membrana vecina, manteniendo efectivamente un "pie" en cada membrana. La resolución del estado lipídico expandido procede espontáneamente para formar la estructura del tallo. En esta visión molecular, el estado intermedio lipídico expandido es la barrera que determina la velocidad en lugar de la formación del tallo, que ahora se convierte en el mínimo de energía libre. La barrera energética para el establecimiento de la conformación lipídica expandida es directamente proporcional a la distancia intermembrana. Por lo tanto, los complejos SNARE y su presión de las dos membranas juntas podrían proporcionar la energía libre necesaria para superar la barrera. [22]
La entrada de energía que se requiere para que se produzca la fusión mediada por SNARE proviene del desmontaje del complejo SNARE. La fuente de energía sospechosa es el factor sensible a la N-etilmaleimida (NSF) , una ATPasa que participa en la fusión de membranas . Los homohexámeros de NSF, junto con el cofactor de NSF α-SNAP , se unen y disocian el complejo SNARE acoplando el proceso con la hidrólisis de ATP . [23] Este proceso permite la recaptación de sinaptobrevina para su uso posterior en vesículas , mientras que las otras proteínas SNARE permanecen asociadas a la membrana celular .
Las proteínas SNARE disociadas tienen un estado energético más alto que el complejo cis -SNARE más estable. Se cree que la energía que impulsa la fusión se deriva de la transición a un complejo cis -SNARE de menor energía. La disociación acoplada a la hidrólisis de ATP de los complejos SNARE es una inversión de energía que se puede comparar con "amartillar el arma" de modo que, una vez que se desencadena la fusión de vesículas , el proceso se lleva a cabo de forma espontánea y a una velocidad óptima. Un proceso comparable tiene lugar en los músculos, en los que las cabezas de miosina primero deben hidrolizar ATP para adaptar la conformación necesaria para que se produzca la interacción con la actina y el golpe de potencia posterior.
La proteína Q-SNARE, proteína asociada a sinaptosomas 25 ( SNAP-25 ), está compuesta por dos dominios α-helicoidales conectados por un enlace de bobina aleatoria . La región del enlace de bobina aleatoria es más notable por sus cuatro residuos de cisteína . [24] Los dominios α-helicoidales se combinan con los de la sintaxina y la sinaptobrevina (también conocida como proteína de membrana asociada a vesículas o VAMP) para formar el complejo SNARE de 4-α-hélices en espiral, fundamental para una exocitosis eficiente .
Si bien la sintaxina y la sinaptobrevina contienen dominios transmembrana que permiten el acoplamiento con las membranas objetivo y vesicular respectivamente, SNAP-25 depende de la palmitoilación de los residuos de cisteína que se encuentran en su región de bobina aleatoria para acoplarse a la membrana objetivo. Algunos estudios han sugerido que la asociación con la sintaxina a través de interacciones SNARE excluye la necesidad de tales mecanismos de acoplamiento. Sin embargo, los estudios de eliminación de sintaxina no lograron mostrar una disminución en SNAP-25 unido a la membrana, lo que sugiere que existen medios de acoplamiento alternativos. [25] Por lo tanto, la unión covalente de las cadenas de ácidos grasos a SNAP-25 a través de enlaces tioéster con uno o más residuos de cisteína proporciona la regulación del acoplamiento y, en última instancia, la exocitosis mediada por SNARE . Este proceso está mediado por una enzima especializada llamada DHHC palmitoil transferasa. [26] También se ha demostrado que el dominio rico en cisteína de SNAP-25 se asocia débilmente con la membrana plasmática, lo que posiblemente le permita localizarse cerca de la enzima para su posterior palmitoilación . El proceso inverso lo lleva a cabo otra enzima llamada palmitoil proteína tioesterasa (véase la figura).
También se ha planteado la teoría de que la disponibilidad de SNAP-25 en el complejo SNARE posiblemente se regule espacialmente a través de la localización de microdominios lipídicos en la membrana diana. Los residuos de cisteína palmitoilados podrían localizarse en la región de membrana diana deseada a través de un entorno lipídico favorable (posiblemente rico en colesterol ) complementario a las cadenas de ácidos grasos unidas a los residuos de cisteína de SNAP-25. [25]
A medida que un potencial de acción alcanza la terminal del axón , los eventos de despolarización estimulan la apertura de los canales de calcio dependientes de voltaje (VGCC), lo que permite la rápida entrada de calcio a lo largo de su gradiente electroquímico . El calcio continúa estimulando la exocitosis a través de la unión con la sinaptotagmina 1. Sin embargo, se ha demostrado que SNAP-25 regula negativamente la función de los VGCC en las células neuronales glutamatérgicas . SNAP-25 conduce a una reducción de la densidad de corriente a través de los VGCC y, por lo tanto, a una disminución de la cantidad de calcio que se une a la sinaptotagmina , lo que provoca una disminución de la exocitosis glutamatérgica neuronal . Por el contrario, la subexpresión de SNAP-25 permite un aumento de la densidad de corriente de los VGCC y un aumento de la exocitosis. [27]
Investigaciones posteriores han sugerido posibles relaciones entre la sobreexpresión/subexpresión de SNAP-25 y una variedad de enfermedades cerebrales . En el trastorno por déficit de atención/hiperactividad o TDAH , los polimorfismos en el locus del gen SNAP-25 en humanos se han vinculado a la enfermedad, lo que sugiere un papel potencial en su manifestación. [28] Esto es sugerido además por estudios heterogéneos de knock out de SNAP-25 realizados en ratones mutantes coloboma , que llevaron a características fenotípicas del TDAH. [29] Los estudios también han demostrado una correlación entre la sobreexpresión/subexpresión de SNAP-25 y la aparición de esquizofrenia . [30] [31]
La sintaxina consta de un dominio transmembrana (TMD), un dominio SNARE alfa-helicoidal , una región de enlace corta y el dominio Habc que consta de tres regiones alfa-helicoidales. El dominio SNARE en la sintaxina sirve como un sitio objetivo para el acoplamiento de SNAP-25 y sinaptobrevina con el fin de formar el haz de cuatro hélices necesario para el complejo SNARE y la posterior fusión . El dominio Habc, sin embargo, sirve como un dominio autoinhibitorio en la sintaxina. Se ha demostrado que se pliega y se asocia con el dominio SNARE de la sintaxina induciendo un estado "cerrado", creando una barrera física para la formación del motivo SNARE . Por el contrario, el dominio Habc puede disociarse nuevamente con el dominio SNARE dejando a la sintaxina libre para asociarse tanto con SNAP-25 como con sinaptobrevina . [32]
Existe una inmensa diversidad de subtipos de sintaxina , con 15 variedades en el genoma humano. [33] Se ha sugerido que la sintaxina 1B tiene un papel en la regulación del número de vesículas sinápticas listas para la exocitosis en la terminal del axón. Esto también se denomina reserva de vesículas fácilmente liberable (RRP) . Un estudio de knock out en 2014 mostró que la falta de sintaxina 1B condujo a una disminución significativa en el tamaño de RRP. [34]
Muchas neurotoxinas afectan directamente a los complejos SNARE. Toxinas como la toxina botulínica y la toxina tetánica actúan sobre los componentes SNARE. Estas toxinas impiden el correcto reciclado de las vesículas y provocan un control muscular deficiente, espasmos, parálisis e incluso la muerte.
La toxina botulínica (BoNT) es una de las toxinas más potentes que se han descubierto jamás. [35] Es una enzima proteolítica que escinde las proteínas SNARE en las neuronas . Su estructura proteica está compuesta por dos subunidades peptídicas, una cadena pesada (100 kDas) y una cadena ligera (50 kDas), que se mantienen unidas por un enlace disulfuro . La acción de la BoNT sigue un mecanismo de 4 pasos que incluye la unión a la membrana neuronal, la endocitosis , la translocación de la membrana y la proteólisis de las proteínas SNARE. [36]
En su mecanismo de acción, la cadena pesada de BoNT se utiliza primero para encontrar sus objetivos neuronales y unirse a los gangliósidos y las proteínas de membrana de las neuronas presinápticas. A continuación, la toxina se endocita en la membrana celular. La cadena pesada sufre un cambio conformacional importante para translocar la cadena ligera al citosol de la neurona. Finalmente, después de que la cadena ligera de BoNT se lleva al citosol de la neurona diana, se libera de la cadena pesada para que pueda alcanzar sus sitios de escisión activos en las proteínas SNARE. [36] La cadena ligera se libera de la cadena pesada por la reducción del enlace disulfuro que mantiene unidas a las dos. La reducción de este enlace disulfuro está mediada por el sistema NADPH- tiorredoxina reductasa - tiorredoxina . [38] La cadena ligera de BoNT actúa como una metaloproteasa en las proteínas SNARE que depende de los iones Zn(II), [39] escindiéndolas y eliminando su función en la exocitosis .
Hay 8 isotipos conocidos de BoNT, BoNT/A – BoNT/H, cada uno con diferentes sitios de escisión específicos en las proteínas SNARE. SNAP25 , un miembro de la familia de proteínas SNARE ubicado en la membrana de las células, es escindido por los isotipos A, C y E de BoNT. La escisión de SNAP-25 por estos isotipos de BoNT inhibe en gran medida su función en la formación del complejo SNARE para la fusión de vesículas a la membrana sináptica. BoNT/C también se dirige a la sintaxina -1, otra proteína SNARE ubicada en la membrana sináptica. Degenera estas proteínas sintaxina con un resultado similar al de SNAP-25. Una tercera proteína SNARE, la sinaptobrevina (VAMP), se encuentra en las vesículas celulares . VAMP2 es el objetivo y escindido por los isotipos B, D y F de BoNT en las neuronas sinápticas. [35] Los objetivos de estos diversos isotipos de BoNT así como de la neurotoxina tetánica (TeNT) se muestran en la figura de la derecha.
En cada uno de estos casos, la toxina botulínica causa daño funcional a las proteínas SNARE, lo que tiene implicaciones fisiológicas y médicas significativas. Al dañar las proteínas SNARE, la toxina impide que las vesículas sinápticas se fusionen con la membrana sináptica y liberen sus neurotransmisores en la hendidura sináptica . Con la inhibición de la liberación de neurotransmisores en la hendidura sináptica, los potenciales de acción no pueden propagarse para estimular las células musculares. Esto da como resultado la parálisis de los infectados y, en casos graves, puede causar la muerte. Aunque los efectos de la toxina botulínica pueden ser fatales, también se ha utilizado como agente terapéutico en tratamientos médicos y cosméticos. [40] [41]
La toxina del tétanos , o TeNT, está compuesta por una cadena pesada (100 kDa) y una cadena ligera (50 kDa) conectadas por un enlace disulfuro . La cadena pesada es responsable de la unión neuroespecífica de la TeNT a la membrana de la terminal nerviosa, la endocitosis de la toxina y la translocación de la cadena ligera al citosol. La cadena ligera tiene actividad de endopeptidasa dependiente de zinc o, más específicamente, de metaloproteinasa de matriz (MMP), a través de la cual se lleva a cabo la escisión de la sinaptobrevina o VAMP. [42]
Para que la cadena ligera de TeNT se active, un átomo de zinc debe estar unido a cada molécula de toxina. [43] Cuando el zinc está unido, la reducción del enlace disulfuro se llevará a cabo principalmente a través del sistema redox NADPH-tiorredoxina reductasa-tiorredoxina . [44] Luego, la cadena ligera queda libre para escindir el enlace Gln76-Phe77 de la sinaptobrevina. [42] La escisión de la sinaptobrevina afecta la estabilidad del núcleo SNARE al restringirle la entrada a la conformación de baja energía que es el objetivo de la unión de NSF . [45] Esta escisión de la sinaptobrevina es el objetivo final de TeNT e incluso en dosis bajas la neurotoxina inhibirá la exocitosis del neurotransmisor .
Los neurotransmisores se almacenan en grupos de vesículas fácilmente liberables confinadas dentro de la terminal presináptica . Durante la neurosecreción / exocitosis , las SNARE desempeñan un papel crucial en el acoplamiento de vesículas, la preparación, la fusión y la sincronización de la liberación de neurotransmisores en la hendidura sináptica .
El primer paso en la fusión de vesículas sinápticas es la unión, donde las vesículas se translocan desde el grupo de reserva hasta el contacto físico con la membrana. En la membrana, Munc-18 se une inicialmente a la sintaxina 1A en una estructura cerrada. Se postula que la disociación de Munc-18 del complejo libera la sintaxina 1A para unirse con las proteínas v-SNARE. [46] El siguiente paso en la liberación es el acoplamiento de vesículas, donde las proteínas v- y t-SNARE se asocian transitoriamente de una manera independiente del calcio. Luego, las vesículas se preparan, donde los motivos SNARE forman una interacción estable entre la vesícula y la membrana. Las complexinas estabilizan el complejo SNARE preparado, lo que hace que las vesículas estén listas para una exocitosis rápida.
La zona de la membrana presináptica que contiene las vesículas preparadas y la densa acumulación de proteínas SNARE se denomina zona activa . Los canales de calcio dependientes del voltaje están altamente concentrados alrededor de las zonas activas y se abren en respuesta a la despolarización de la membrana en la sinapsis. La sinaptotagmina 1 detecta la entrada de calcio , que a su vez desaloja la proteína complexina y permite que la vesícula se fusione con la membrana presináptica para liberar el neurotransmisor. También se ha demostrado que los canales de calcio dependientes del voltaje interactúan directamente con las t-SNARE sintaxina 1A y SNAP-25, así como con la sinaptotagmina 1. Las interacciones pueden inhibir la actividad del canal de calcio, así como agregar firmemente las moléculas alrededor del sitio de liberación. [47]
Se han descrito numerosos casos clínicos que vinculan los genes SNARE con trastornos neuronales. Se ha observado una deficiencia en el ARNm de SNAP-25 en el tejido hipocampal de algunos pacientes esquizofrénicos , un polimorfismo de un solo nucleótido de SNAP-25 está vinculado a la hiperactividad en los trastornos del espectro autista y la sobreexpresión de SNAP-25B conduce a la aparición temprana del trastorno bipolar . [47]
La macroautofagia es un proceso catabólico que implica la formación de orgánulos unidos por una doble membrana llamados autofagosomas , que ayudan en la degradación de los componentes celulares a través de la fusión con los lisosomas . Durante la autofagia , partes del citoplasma son engullidas por una estructura de doble membrana en forma de copa llamada fagóforo y eventualmente se convierten en el contenido del autofagosoma completamente ensamblado. La biogénesis del autofagosoma requiere la iniciación y el crecimiento de los fagóforos, un proceso que alguna vez se pensó que ocurría a través de la adición de novo de lípidos. Sin embargo, evidencia reciente sugiere que los lípidos que contribuyen al crecimiento de los fagóforos se originan de numerosas fuentes de membrana, incluido el retículo endoplasmático , el Golgi , la membrana plasmática y las mitocondrias . [48] Las SNARE desempeñan un papel importante en la mediación de la fusión de vesículas durante la iniciación y expansión del fagóforo, así como en la fusión autofagosoma-lisosoma en las etapas posteriores de la autofagia.
Aunque se desconoce el mecanismo de iniciación del fagóforo en mamíferos, las SNARE se han implicado en la formación del fagóforo a través de la fusión homotípica de pequeñas vesículas de membrana única recubiertas de clatrina que contienen Atg16L, la v-SNARE VAMP7 y sus t-SNARE asociadas: sintaxina-7 , sintaxina-8 y VTI1B . [49] En levadura, las t-SNARE Sec9p y Sso2p son necesarias para la exocitosis y promueven la gemación tubulovesicular de vesículas positivas para Atg9, que también son necesarias para la biogénesis del autofagosoma. [50] [51] La eliminación de cualquiera de estas SNARE conduce a la acumulación de pequeñas vesículas que contienen Atg9 que no se fusionan, lo que impide la formación de la estructura preautofagosómica. [51]
Además del ensamblaje del fagóforo, las SNARE también son importantes para mediar la fusión autofagosoma-lisosoma. En los mamíferos, las SNARE VAMP7 , VAMP8 y VTI1B son necesarias en la fusión autofagosoma-lisosoma y este proceso se ve afectado en los trastornos de almacenamiento lisosomal donde el colesterol se acumula en el lisosoma y secuestra las SNARE en regiones ricas en colesterol de la membrana impidiendo su reciclaje. [52] Recientemente, se identificó la sintaxina 17 ( STX17 ) como una SNARE asociada al autofagosoma que interactúa con VAMP8 y SNAP29 y es necesaria para la fusión con el lisosoma. [53] STX17 se localiza en la membrana externa de los autofagosomas, pero no en los fagóforos u otros precursores del autofagosoma, lo que evita que se fusionen prematuramente con el lisosoma. [53] En la levadura, la fusión de los autofagosomas con las vacuolas (el equivalente de los lisosomas en la levadura) requiere SNARE y proteínas relacionadas, como el homólogo de sintaxina Vam3, el homólogo de SNAP-25 Vam7, la GTPasa similar a Ras Ypt7 y el ortólogo NSF, Sec18. [48]
Se sabe que varios complejos sustituyen de forma flexible una proteína por otra: dos Qa-SNARE en levaduras pueden sustituirse entre sí hasta cierto punto. Las levaduras que pierden el R-SNARE (Sec22p) aumentan automáticamente los niveles de un homólogo (Ykt6p) y lo utilizan de la misma manera. Aunque Drosophilae no puede sobrevivir a la pérdida del componente SNAP-25 , SNAP-24 puede reemplazarlo por completo. Y también en Drosophila , un R-SNARE que normalmente no se encuentra en las sinapsis puede sustituir a la sinaptobrevina . [6]
Las SNARE también se encuentran en plantas, donde son esenciales para el transporte de vesículas hacia y desde el RE, el Golgi, la red trans-Golgi/endosoma temprano, la membrana plasmática y la vacuola. [54]
