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Fusión de bicapa lipídica

Ilustración de la fusión de vesículas lipídicas que muestra dos posibles resultados: hemifusión y fusión completa. En hemifusión sólo se mezclan las valvas bicapa exteriores. En plena fusión se mezclan tanto las valvas como el contenido interno.

En biología de membranas , la fusión es el proceso mediante el cual dos bicapas lipídicas inicialmente distintas fusionan sus núcleos hidrofóbicos , dando como resultado una estructura interconectada. Si esta fusión se produce completamente a través de ambas valvas de ambas bicapas, se forma un puente acuoso y los contenidos internos de las dos estructuras pueden mezclarse. Alternativamente, si en el proceso de fusión sólo interviene una valva de cada bicapa, se dice que las bicapas están hemifusionadas. En la hemifusión, los constituyentes lipídicos de la valva externa de las dos bicapas pueden mezclarse, pero las valvas internas permanecen distintas. Los contenidos acuosos encerrados por cada bicapa también permanecen separados.

La fusión está implicada en muchos procesos celulares, particularmente en eucariotas , ya que la célula eucariota está ampliamente subdividida por membranas bicapa lipídica. La exocitosis , la fertilización de un óvulo por el espermatozoide y el transporte de productos de desecho al lisosoma son algunos de los muchos procesos eucarióticos que dependen de alguna forma de fusión. La fusión también es un mecanismo importante para el transporte de lípidos desde su sitio de síntesis hasta la membrana donde son necesarios. Incluso la entrada de patógenos puede estar gobernada por la fusión, ya que muchos virus recubiertos con bicapa tienen proteínas de fusión dedicadas para entrar en la célula huésped.

Mecanismo lipídico

Hay cuatro pasos fundamentales en el proceso de fusión, aunque cada uno de estos pasos en realidad representa una secuencia compleja de eventos. [1] Primero, las membranas involucradas deben agregarse, acercándose entre sí dentro de varios nanómetros. En segundo lugar, las dos bicapas deben entrar en contacto muy estrecho (dentro de unos pocos angstroms). Para lograr este estrecho contacto, las dos superficies deben deshidratarse al menos parcialmente, ya que el agua superficial unida normalmente presente hace que las bicapas se repelan fuertemente a esta distancia. En tercer lugar, debe desarrollarse una desestabilización en un punto entre las dos bicapas, induciendo una reorganización altamente localizada de las dos bicapas. Finalmente, a medida que este defecto puntual crece, los componentes de las dos bicapas se mezclan y se difunden lejos del sitio de contacto. Dependiendo de si se produce hemifusión o fusión completa, los contenidos internos de las membranas también pueden mezclarse en este punto.

Ilustración esquemática del proceso de fusión mediante la formación de tallos.

The exact mechanisms behind this complex sequence of events are still a matter of debate. To simplify the system and allow more definitive study, many experiments have been performed in vitro with synthetic lipid vesicles. These studies have shown that divalent cations play a critical role in the fusion process by binding to negatively charged lipids such as phosphatidylserine, phosphatidylglycerol and cardiolipin.[2] One role on these ions in the fusion process is to shield the negative charge on the surface of the bilayer, diminishing electrostatic repulsion and allowing the membranes to approach each other. This is clearly not the only role, however, since there is an extensively documented difference in the ability of Mg2+ versus Ca2+ to induce fusion. Although Mg2+ will induce extensive aggregation it will not induce fusion, while Ca2+ induces both.[3] It has been proposed that this discrepancy is due to a difference in extent of dehydration. Under this theory, calcium ions bind more strongly to charged lipids, but less strongly to water. The resulting displacement of calcium for water destabilizes the lipid-water interface and promotes intimate interbilayer contact.[4] A recently proposed alternative hypothesis is that the binding of calcium induces a destabilizing lateral tension.[5] Whatever the mechanism of calcium-induced fusion, the initial interaction is clearly electrostatic, since zwitterionic lipids are not susceptible to this effect.[6][7]

En el proceso de fusión, el grupo de cabeza de lípidos no solo participa en la densidad de carga, sino que también puede afectar la deshidratación y la nucleación de defectos. Estos efectos son independientes de los efectos de los iones. La presencia del grupo principal fosfatidiletanolamina (PE) sin carga aumenta la fusión cuando se incorpora a una bicapa de fosfatidilcolina. Algunos han explicado este fenómeno como un efecto de deshidratación similar a la influencia del calcio. [8] El grupo principal de PE se une al agua con menos fuerza que el PC y, por lo tanto, puede permitir una aposición cercana más fácilmente. Una explicación alternativa es que la naturaleza física más que química del PE puede ayudar a inducir la fusión. Según la hipótesis de la fusión del tallo, debe formarse un puente muy curvado entre las dos bicapas para que se produzca la fusión. [9] Dado que PE tiene un grupo de cabeza pequeño y forma fácilmente fases micelares invertidas , según el modelo de tallo, debería promover la formación de estos tallos. [10] Otra evidencia citada a favor de esta teoría es el hecho de que se ha demostrado que ciertas mezclas de lípidos solo apoyan la fusión cuando se elevan por encima de la temperatura de transición de estas fases invertidas. [11] [12] Este tema también sigue siendo controvertido, e incluso si hay una estructura curva presente en el proceso de fusión, hay debate en la literatura sobre si se trata de una fase extendida cúbica, hexagonal o más exótica. [13]

Proteínas de fusión

Diagrama de la acción de las proteínas SNARE acoplando una vesícula para exocitosis. Las versiones complementarias de la proteína en la vesícula y la membrana objetivo se unen y se envuelven entre sí, acercando las dos bicapas en el proceso. [14]

La situación se complica aún más cuando se considera la fusión in vivo ya que la fusión biológica casi siempre está regulada por la acción de proteínas asociadas a la membrana . Las primeras de estas proteínas en ser estudiadas fueron las proteínas de fusión viral, que permiten que un virus envuelto inserte su material genético en la célula huésped (los virus envueltos son aquellos rodeados por una bicapa lipídica; algunos otros solo tienen una cubierta proteica). En términos generales, existen dos clases de proteínas de fusión viral: ácidas e independientes del pH. [1] Las proteínas de fusión independientes del pH pueden funcionar en condiciones neutras y fusionarse con la membrana plasmática , permitiendo la entrada viral a la célula. Los virus que utilizaron este esquema incluyeron el VIH , el sarampión y el herpes . Las proteínas de fusión ácidas, como las que se encuentran en la influenza , solo se activan cuando están en el pH bajo de los endosomas ácidos y primero deben endocitarse para poder ingresar a la célula.

Las células eucariotas utilizan clases completamente diferentes de proteínas de fusión, las mejor estudiadas son las SNARE . Las proteínas SNARE se utilizan para dirigir todo el tráfico intracelular vesicular . A pesar de años de estudio, todavía se desconoce mucho sobre la función de esta clase de proteínas. De hecho, todavía existe un debate activo sobre si los SNARE están relacionados con el acoplamiento temprano o participan más tarde en el proceso de fusión facilitando la hemifusión. [15] Incluso una vez que se esclarezca el papel de las SNARE u otras proteínas específicas, es poco probable una comprensión unificada de las proteínas de fusión, ya que existe una enorme diversidad de estructuras y funciones dentro de estas clases, y se conservan muy pocos temas. [dieciséis]

Fusión en la práctica de laboratorio.

En estudios de biología molecular y celular, a menudo es deseable inducir artificialmente la fusión. Aunque esto se puede lograr con la adición de calcio como se analizó anteriormente, este procedimiento a menudo no es factible porque el calcio regula muchos otros procesos bioquímicos y su adición sería una gran confusión. Además, como se mencionó, el calcio induce tanto la agregación masiva como la fusión. La adición de polietilenglicol (PEG) provoca la fusión sin agregación significativa ni alteración bioquímica. Este procedimiento se utiliza ahora ampliamente, por ejemplo mediante la fusión de células B con células de mieloma . [17] El “ hibridoma ” resultante de esta combinación expresa un anticuerpo deseado según lo determinado por la célula B involucrada, pero se inmortaliza debido al componente de mieloma. El mecanismo de fusión de PEG no se ha identificado definitivamente, pero algunos investigadores creen que el PEG, al unir una gran cantidad de moléculas de agua, disminuye efectivamente la actividad química del agua y, por lo tanto, deshidrata los grupos lipídicos. [18] La fusión también se puede inducir artificialmente mediante electroporación en un proceso conocido como electrofusión. Se cree que este fenómeno resulta de los bordes energéticamente activos formados durante la electroporación, que pueden actuar como punto de defecto local para nuclear el crecimiento del tallo entre dos bicapas. [19]

Alternativamente, se pueden utilizar sistemas modelo inspirados en SNARE para inducir la fusión de membranas de vesículas lipídicas. En esos sistemas, el ADN complementario anclado a la membrana, [20] [21] [22] PNA, [23] péptidos, [24] u otras moléculas [25] se "comprimen" y acercan las membranas. Estos sistemas podrían tener aplicaciones prácticas en el futuro, por ejemplo en la administración de fármacos. [26] El sistema probablemente mejor investigado [27] consiste en péptidos de carga complementaria que forman espirales (uno normalmente lleva un exceso de lisinas cargadas positivamente y, por lo tanto, se denomina péptido K, y el otro, ácidos glutámicos cargados negativamente, se llama péptido E). [28] Curiosamente, se descubrió que no sólo la formación de espirales entre los dos péptidos es necesaria para que se produzca la fusión de la membrana, sino también que el péptido K interactúa con la superficie de la membrana y causa defectos locales. [29]

Ensayos para medir la fusión de membranas.

Hay dos niveles de fusión: mezcla de lípidos de membrana y mezcla de contenidos. Los ensayos de fusión de membranas informan sobre la mezcla de lípidos de membrana o la mezcla de los contenidos acuosos de las entidades fusionadas.

Ensayos para medir la mezcla de lípidos.

Los ensayos que evalúan la mezcla de lípidos utilizan efectos dependientes de la concentración, como la transferencia de energía no radiativa, la extinción de la fluorescencia y la formación de excímeros de pireno.

(1.) Ilustración del ensayo de mezcla de lípidos basado en la transferencia de energía por resonancia de Förster.
(3.) Ilustración del ensayo de mezcla de lípidos basado en la autoextinción de fluorescencia.
  1. Transferencia de energía NBD-Rodamina: [30] En este método, la membrana marcada con NBD (donante) y Rodamina (aceptor) se combina con una membrana sin marcar. Cuando NBD y rodamina están a cierta distancia, se produce la transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET). Después de la fusión, la transferencia de energía de resonancia (FRET) disminuye cuando aumenta la distancia promedio entre sondas, mientras que aumenta la fluorescencia NBD.
  2. Formación de excímeros de pireno: Las longitudes de onda de emisión del monómero de pireno y del excímero son diferentes. La longitud de onda de emisión del monómero es de unos 400 nm y la del excímero es de unos 470 nm. En este método, la membrana marcada con pireno se combina con una membrana sin marcar. El pireno se autoasocia en la membrana y luego el pireno excitado excita a otros pirenos. Antes de la fusión, la mayor parte de la emisión es emisión de excímeros. Después de la fusión, la distancia entre las sondas aumenta y la proporción de emisión de excímeros disminuye. [ cita necesaria ]
  3. Autoextinción de octadecil rodamina B: [31] Este ensayo se basa en la autoextinción de octadecil rodamina B. La autoextinción de octadecil rodamina B ocurre cuando la sonda se incorpora a lípidos de membrana en concentraciones de 1 a 10 por ciento molar [32] porque Los dímeros de rodamina apagan la fluorescencia. En este método, la rodamina marcada con una membrana se combina con una membrana sin marcar. La fusión con membranas sin marcar da como resultado la dilución de la sonda, lo que se acompaña de un aumento de la fluorescencia. [33] [34] El principal problema de este ensayo es la transferencia espontánea.

Ensayos para medir la mezcla de contenidos.

La mezcla de contenidos acuosos de vesículas como resultado de lisis, fusión o permeabilidad fisiológica se puede detectar fluorométricamente utilizando trazadores solubles de bajo peso molecular.

(1.) Ilustración del ensayo de mezcla de contenidos basado en el par de secuenciación de fluorescencia ANTS/DPX.
(2.) Ilustración del ensayo de mezcla de contenidos basado en el par de mejora de fluorescencia Tb 3+ /DPA.
  1. Ensayos de extinción de fluorescencia con ANTS/DPX: [35] [36] ANTS es un fluoróforo polianiónico, mientras que DPX es un extintor catiónico. El ensayo se basa en el enfriamiento por colisión de los mismos. Se cargan poblaciones de vesículas separadas con ANTS o DPX, respectivamente. Cuando se produce la mezcla de contenidos, ANTS y ​​DPX chocan y se apaga la fluorescencia de ANTS monitoreada a 530 nm, con excitación a 360 nm. Este método se realiza a pH ácido y alta concentración.
  2. Ensayos de mejora de la fluorescencia con Tb 3+ /DPA: [37] [38] Este método se basa en el hecho de que el quelato de Tb 3+ /DPA es 10.000 veces más fluorescente que el Tb 3+ solo. En el ensayo Tb 3+ /DPA, se cargan poblaciones de vesículas separadas con TbCl 3 o DPA. La formación de quelato Tb 3+ /DPA se puede utilizar para indicar la fusión de vesículas. Este método es bueno para membranas libres de proteínas. [ cita necesaria ]
  3. Ensayo de ADN de molécula única. [39] En la vesícula v-SNARE se encapsuló una horquilla de ADN compuesta por un tallo de 5 pares de bases y un bucle de politimidina que está marcado con un donante (Cy3) y un aceptor (Cy5) en los extremos del tallo. Encapsulamos por separado múltiples hebras de ADN de poliadenosina sin marcar en la vesícula t-SNARE. Si las dos vesículas, ambas de ~100 nm de diámetro, se acoplan y se forma un poro de fusión lo suficientemente grande entre ellas, las dos moléculas de ADN deberían hibridarse, abriendo la región del tallo de la horquilla y cambiando la eficiencia de la transferencia de energía por resonancia de Förster (FRET). E) entre Cy3 y Cy5 de un valor alto a un valor bajo.

Ver también

Referencias

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