Una enzima de restricción , endonucleasa de restricción , REasa , ENasa o restrictasa es una enzima que escinde el ADN en fragmentos en o cerca de sitios de reconocimiento específicos dentro de moléculas conocidas como sitios de restricción . [1] [2] [3] Las enzimas de restricción son una clase del grupo más amplio de enzimas endonucleasas . Las enzimas de restricción se clasifican comúnmente en cinco tipos, que difieren en su estructura y en si cortan su sustrato de ADN en su sitio de reconocimiento, o si los sitios de reconocimiento y escisión están separados entre sí. Para cortar el ADN, todas las enzimas de restricción realizan dos incisiones, una a través de cada columna vertebral de azúcar-fosfato (es decir, cada hebra) de la doble hélice del ADN .
Estas enzimas se encuentran en bacterias y arqueas y proporcionan un mecanismo de defensa contra virus invasores . [4] [5] Dentro de un procariota , las enzimas de restricción cortan selectivamente el ADN extraño en un proceso llamado digestión de restricción ; Mientras tanto, el ADN del huésped está protegido por una enzima de modificación (una metiltransferasa ) que modifica el ADN procariótico y bloquea la escisión. Juntos, estos dos procesos forman el sistema de modificación de restricciones . [6]
Se conocen más de 3.600 endonucleasas de restricción que representan más de 250 especificidades diferentes. [7] Se han estudiado en detalle más de 3.000 de ellos y más de 800 de ellos están disponibles comercialmente. [8] Estas enzimas se utilizan habitualmente para la modificación del ADN en laboratorios y son una herramienta vital en la clonación molecular . [9] [10] [11]
El término enzima de restricción se originó a partir de los estudios del fago λ , un virus que infecta bacterias, y el fenómeno de restricción y modificación controlada por el huésped de dicho fago o bacteriófago bacteriano . [12] El fenómeno fue identificado por primera vez en un trabajo realizado en los laboratorios de Salvador Luria , Jean Weigle y Giuseppe Bertani a principios de los años cincuenta. [13] [14] Se descubrió que, para un bacteriófago λ que puede crecer bien en una cepa de Escherichia coli , por ejemplo E. coli C, cuando se cultiva en otra cepa, por ejemplo E. coli K, sus rendimientos pueden disminuir. significativamente, entre tres y cinco órdenes de magnitud. La célula huésped, en este ejemplo E. coli K, se conoce como huésped restrictivo y parece tener la capacidad de reducir la actividad biológica del fago λ. Si un fago se establece en una cepa, la capacidad de ese fago para crecer también queda restringida en otras cepas. En los años 60 se demostró en trabajos realizados en los laboratorios de Werner Arber y Matthew Meselson que la restricción se debía a una escisión enzimática del ADN del fago, por lo que la enzima implicada se denominó enzima de restricción. [4] [15] [16] [17]
Las enzimas de restricción estudiadas por Arber y Meselson eran enzimas de restricción de tipo I, que escinden el ADN aleatoriamente del sitio de reconocimiento. [18] En 1970, Hamilton O. Smith , Thomas Kelly y Kent Wilcox aislaron y caracterizaron la primera enzima de restricción de tipo II, HindII, de la bacteria Haemophilus influenzae . [19] [20] Las enzimas de restricción de este tipo son más útiles para el trabajo de laboratorio ya que escinden el ADN en el sitio de su secuencia de reconocimiento y son las más comúnmente utilizadas como herramienta de biología molecular. [21] Más tarde, Daniel Nathans y Kathleen Danna demostraron que la escisión del ADN del virus simio 40 (SV40) mediante enzimas de restricción produce fragmentos específicos que pueden separarse mediante electroforesis en gel de poliacrilamida , lo que demuestra que las enzimas de restricción también se pueden utilizar para mapear el ADN. [22] Por su trabajo en el descubrimiento y caracterización de enzimas de restricción, el Premio Nobel de Fisiología o Medicina de 1978 fue otorgado a Werner Arber , Daniel Nathans y Hamilton O. Smith . [23] El descubrimiento de las enzimas de restricción permite manipular el ADN, lo que lleva al desarrollo de tecnología de ADN recombinante que tiene muchas aplicaciones, por ejemplo, permitiendo la producción a gran escala de proteínas como la insulina humana utilizada por pacientes diabéticos . [13] [24]
Las enzimas de restricción probablemente evolucionaron a partir de un ancestro común y se generalizaron mediante la transferencia horizontal de genes . [25] [26] Además, cada vez hay más pruebas de que las endonucleasas de restricción evolucionaron como un elemento genético egoísta . [27]
Las enzimas de restricción reconocen una secuencia específica de nucleótidos [2] y producen un corte bicatenario en el ADN. Las secuencias de reconocimiento también pueden clasificarse por el número de bases en su sitio de reconocimiento, normalmente entre 4 y 8 bases, y el número de bases en la secuencia determinará con qué frecuencia aparecerá el sitio por casualidad en cualquier genoma dado, por ejemplo, un En teoría, la secuencia de 4 pares de bases ocurriría una vez cada 4 ^ 4 o 256 pb, 6 bases, 4 ^ 6 o 4096 pb, y 8 bases serían 4 ^ 8 o 65,536 pb. [28] Muchos de ellos son palindrómicos , lo que significa que la secuencia de bases se lee igual hacia adelante y hacia atrás. [29] En teoría, hay dos tipos de secuencias palindrómicas que pueden ser posibles en el ADN. El palíndromo en forma de espejo es similar a los que se encuentran en el texto ordinario, en el que una secuencia se lee igual hacia adelante y hacia atrás en una sola hebra de ADN, como en GTAATG. El palíndromo de repetición invertida también es una secuencia que se lee igual hacia adelante y hacia atrás, pero las secuencias hacia adelante y hacia atrás se encuentran en cadenas de ADN complementarias (es decir, de ADN bicatenario), como en GTATAC (siendo GTATAC complementario de CATATG). [30] Los palíndromos de repetición invertida son más comunes y tienen mayor importancia biológica que los palíndromos en forma de espejo.
La digestión con EcoRI produce extremos "pegajosos" ,
mientras que la escisión de la enzima de restricción SmaI produce extremos "romos" :
Las secuencias de reconocimiento en el ADN difieren para cada enzima de restricción, lo que produce diferencias en la longitud, secuencia y orientación de la cadena ( extremo 5' o extremo 3' ) de un "sobresaliente" del extremo adhesivo de una enzima de restricción. [31]
Las diferentes enzimas de restricción que reconocen una misma secuencia se conocen como neoesquizómeros . Estos a menudo se escinden en diferentes lugares de la secuencia. Las diferentes enzimas que reconocen y escinden en el mismo lugar se conocen como isosquizómeros .
Las endonucleasas de restricción naturales se clasifican en cinco grupos (Tipos I, II, III, IV y V) según su composición y requisitos de cofactor enzimático , la naturaleza de su secuencia objetivo y la posición de su sitio de escisión de ADN en relación con el objetivo. secuencia. [32] [33] [34] Sin embargo, el análisis de la secuencia de ADN de las enzimas de restricción muestra grandes variaciones, lo que indica que existen más de cuatro tipos. [35] Todos los tipos de enzimas reconocen secuencias cortas específicas de ADN y llevan a cabo la escisión endonucleolítica del ADN para dar fragmentos específicos con 5'-fosfatos terminales. Se diferencian en su secuencia de reconocimiento, composición de subunidades, posición de escisión y requisitos de cofactor, [36] [37] como se resume a continuación:
Las enzimas de restricción tipo I fueron las primeras en identificarse y se identificaron por primera vez en dos cepas diferentes (K-12 y B) de E. coli . [38] Estas enzimas cortan en un sitio que difiere y está a una distancia aleatoria (al menos 1000 pb) de su sitio de reconocimiento. La escisión en estos sitios aleatorios sigue un proceso de translocación del ADN, lo que muestra que estas enzimas también son motores moleculares. El sitio de reconocimiento es asimétrico y está compuesto por dos porciones específicas (una que contiene de 3 a 4 nucleótidos y otra que contiene de 4 a 5 nucleótidos) separadas por un espaciador no específico de aproximadamente 6 a 8 nucleótidos. Estas enzimas son multifuncionales y son capaces tanto de digestión de restricción como de actividades de modificación, dependiendo del estado de metilación del ADN objetivo. Los cofactores S-adenosil metionina (AdoMet), trifosfato de adenosina hidrolizado ( ATP ) y iones de magnesio (Mg 2+ ) son necesarios para su plena actividad. Las enzimas de restricción de tipo I poseen tres subunidades llamadas HsdR, HsdM y HsdS; Se requiere HsdR para la digestión de restricción; HsdM es necesario para agregar grupos metilo al ADN del huésped (actividad metiltransferasa), y HsdS es importante para la especificidad del sitio de reconocimiento (unión al ADN), además de la actividad de digestión de restricción (escisión del ADN) y de modificación (ADN metiltransferasa). [32] [38]
Las enzimas de restricción típicas de tipo II se diferencian de las enzimas de restricción de tipo I en varios aspectos. Forman homodímeros , con sitios de reconocimiento que suelen ser indivisos y palindrómicos y de 4 a 8 nucleótidos de longitud. Reconocen y escinden el ADN en el mismo sitio y no utilizan ATP ni AdoMet para su actividad; por lo general requieren sólo Mg 2+ como cofactor. [29] Estas enzimas escinden el enlace fosfodiéster del ADN de doble hélice. Puede dividirse en el centro de ambas hebras para producir un extremo romo o en una posición escalonada dejando salientes llamados extremos pegajosos. [40] Estas son las enzimas de restricción más comúnmente disponibles y utilizadas. En la década de 1990 y principios de la de 2000, se descubrieron nuevas enzimas de esta familia que no seguían todos los criterios clásicos de esta clase de enzimas, y se desarrolló una nueva nomenclatura de subfamilia para dividir esta gran familia en subcategorías basadas en desviaciones de las características típicas de las enzimas de tipo II. . [29] Estos subgrupos se definen mediante un sufijo de letra.
Las enzimas de restricción de tipo IIB (p. ej., BcgI y BplI) son multímeros que contienen más de una subunidad. [29] Dividen el ADN en ambos lados de su reconocimiento para cortar el sitio de reconocimiento. Requieren cofactores tanto AdoMet como Mg 2+ . Las endonucleasas de restricción de tipo IIE (p. ej., NaeI) escinden el ADN tras la interacción con dos copias de su secuencia de reconocimiento. [29] Un sitio de reconocimiento actúa como objetivo para la escisión, mientras que el otro actúa como un efector alostérico que acelera o mejora la eficiencia de la escisión enzimática. De manera similar a las enzimas de tipo IIE, las endonucleasas de restricción de tipo IIF (p. ej., NgoMIV) interactúan con dos copias de su secuencia de reconocimiento pero escinden ambas secuencias al mismo tiempo. [29] Las endonucleasas de restricción de tipo IIG (p. ej., RM.Eco57I) tienen una sola subunidad, como las enzimas de restricción de tipo II clásicas, pero requieren que el cofactor AdoMet esté activo. [29] Las endonucleasas de restricción de tipo IIM, como DpnI, son capaces de reconocer y cortar el ADN metilado. [29] [41] [42] Las endonucleasas de restricción de tipo IIS (por ejemplo, FokI) escinden el ADN a una distancia definida de sus sitios de reconocimiento asimétricos no palindrómicos; [29] esta característica es ampliamente utilizada para realizar técnicas de clonación in vitro como la clonación Golden Gate . Estas enzimas pueden funcionar como dímeros . De manera similar, las enzimas de restricción de tipo IIT (p. ej., Bpu10I y BslI) están compuestas de dos subunidades diferentes. Algunos reconocen secuencias palindrómicas mientras que otros tienen sitios de reconocimiento asimétricos. [29]
Las enzimas de restricción de tipo III (p. ej., EcoP15) reconocen dos secuencias no palindrómicas separadas que están orientadas inversamente. Cortan el ADN entre 20 y 30 pares de bases después del sitio de reconocimiento. [43] Estas enzimas contienen más de una subunidad y requieren cofactores AdoMet y ATP para sus funciones en la metilación del ADN y la digestión de restricción, respectivamente. [44] Son componentes de los mecanismos de restricción-modificación del ADN procariótico que protegen al organismo contra la invasión de ADN extraño. Las enzimas de tipo III son proteínas heterooligoméricas multifuncionales compuestas de dos subunidades, Res ( P08764 ) y Mod ( P08763 ). La subunidad Mod reconoce la secuencia de ADN específica del sistema y es una modificación de la metiltransferasa ; como tal, es funcionalmente equivalente a las subunidades M y S de la endonucleasa de restricción tipo I. Res es necesario para la digestión de restricción, aunque no tiene actividad enzimática por sí solo. Las enzimas de tipo III reconocen secuencias cortas de ADN asimétricas de 5 a 6 pb de largo y escinden de 25 a 27 pb en sentido descendente para dejar protuberancias 5' cortas y monocatenarias. Requieren la presencia de dos sitios de reconocimiento no metilados orientados inversamente para que se produzca la digestión de restricción. Estas enzimas metilan sólo una hebra del ADN, en la posición N-6 de los residuos de adenina, por lo que el ADN recién replicado tendrá sólo una hebra metilada, lo que es suficiente para proteger contra la digestión de restricción. Las enzimas de tipo III pertenecen a la subfamilia beta de las adenina metiltransferasas N6 y contienen los nueve motivos que caracterizan a esta familia, incluido el motivo I, el bolsillo de unión de AdoMet (FXGXG) y el motivo IV, la región catalítica (S/D/N (PP). ) S/F). [36] [45]
Las enzimas de tipo IV reconocen ADN modificado, típicamente metilado, y están ejemplificadas por los sistemas McrBC y Mrr de E. coli . [35]
Las enzimas de restricción de tipo V (p. ej., el complejo cas9 -ARNg de CRISPR [46] ) utilizan ARN guía para apuntar a secuencias no palindrómicas específicas que se encuentran en organismos invasores. Pueden cortar ADN de longitud variable, siempre que se proporcione un ARN guía adecuado. La flexibilidad y facilidad de uso de estas enzimas las hacen prometedoras para futuras aplicaciones de ingeniería genética. [46] [47]
Se pueden generar enzimas de restricción artificiales fusionando un dominio de unión al ADN natural o diseñado con un dominio de nucleasa (a menudo el dominio de escisión de la enzima de restricción de tipo IIS FokI ). [48] Estas enzimas de restricción artificiales pueden apuntar a sitios de ADN grandes (hasta 36 pb) y pueden diseñarse para unirse a las secuencias de ADN deseadas. [49] Las nucleasas con dedos de zinc son las enzimas de restricción artificiales más comúnmente utilizadas y generalmente se usan en aplicaciones de ingeniería genética , [50] [51] [52] [53] pero también se pueden usar para aplicaciones de clonación de genes más estándar . [54] Otras enzimas de restricción artificiales se basan en el dominio de unión al ADN de los efectores TAL . [55] [56]
En 2013, se diseñó una nueva tecnología CRISPR-Cas9, basada en un sistema de defensa viral procariota, para editar el genoma, que fue rápidamente adoptada en los laboratorios. [57] Para obtener más detalles, lea CRISPR (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente espaciadas).
En 2017, un grupo de la Universidad de Illinois informó que utilizó una proteína Argonauta extraída de Pyrococcus furiosus (PfAgo) junto con ADN guía para editar ADN in vitro como enzimas de restricción artificiales. [58]
También se han desarrollado ribonucleasas artificiales que actúan como enzimas de restricción para el ARN. Un sistema basado en PNA , llamado PNAzima, tiene un grupo Cu(II) -2,9-dimetilfenantrolina que imita las ribonucleasas para una secuencia de ARN específica y se escinde en una región sin pares de bases (protuberancia de ARN) del ARN objetivo formado cuando la enzima se une al ARN. Esta enzima muestra selectividad al escindirse solo en un sitio que no tiene una falta de coincidencia o es cinéticamente preferido entre dos posibles sitios de escisión. [59]
Desde su descubrimiento en la década de 1970, se han identificado muchas enzimas de restricción; por ejemplo, se han caracterizado más de 3500 enzimas de restricción de tipo II diferentes. [60] Cada enzima lleva el nombre de la bacteria de la que se aisló, utilizando un sistema de denominación basado en el género , la especie y la cepa bacteriana . [61] [62] Por ejemplo, el nombre de la enzima de restricción EcoRI se obtuvo como se muestra en el cuadro.
Las enzimas de restricción aisladas se utilizan para manipular el ADN para diferentes aplicaciones científicas.
Se utilizan para ayudar a la inserción de genes en vectores plásmidos durante experimentos de clonación de genes y producción de proteínas . Para un uso óptimo, los plásmidos que se utilizan comúnmente para la clonación de genes se modifican para incluir una secuencia polienlazadora corta (llamada sitio de clonación múltiple o MCS) rica en secuencias de reconocimiento de restricción . Esto permite flexibilidad al insertar fragmentos de genes en el vector plasmídico; los sitios de restricción contenidos naturalmente dentro de los genes influyen en la elección de la endonucleasa para digerir el ADN, ya que es necesario evitar la restricción del ADN deseado mientras se cortan intencionalmente los extremos del ADN. Para clonar un fragmento de gen en un vector, tanto el ADN plasmídico como el inserto del gen generalmente se cortan con las mismas enzimas de restricción y luego se pegan con la ayuda de una enzima conocida como ADN ligasa . [63] [64]
Las enzimas de restricción también se pueden utilizar para distinguir alelos genéticos reconociendo específicamente cambios de una sola base en el ADN, conocidos como polimorfismos de un solo nucleótido (SNP). [65] [66] Sin embargo, esto sólo es posible si un SNP altera el sitio de restricción presente en el alelo. En este método, la enzima de restricción se puede utilizar para genotipar una muestra de ADN sin la necesidad de una costosa secuenciación de genes . La muestra primero se digiere con la enzima de restricción para generar fragmentos de ADN y luego se separan los fragmentos de diferentes tamaños mediante electroforesis en gel . En general, los alelos con sitios de restricción correctos generarán dos bandas visibles de ADN en el gel, y aquellos con sitios de restricción alterados no se cortarán y generarán una sola banda. También se puede generar un mapa de ADN mediante digestión de restricción que puede proporcionar las posiciones relativas de los genes. [67] Las diferentes longitudes de ADN generadas mediante digestión de restricción también producen un patrón específico de bandas después de la electroforesis en gel, y pueden usarse para la toma de huellas dactilares de ADN .
De manera similar, se utilizan enzimas de restricción para digerir el ADN genómico para el análisis genético mediante transferencia Southern . Esta técnica permite a los investigadores identificar cuántas copias (o parálogos ) de un gen están presentes en el genoma de un individuo, o cuántas mutaciones genéticas ( polimorfismos ) han ocurrido dentro de una población. El último ejemplo se denomina polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP). [68]
Las enzimas de restricción artificiales creadas uniendo el dominio de escisión del ADN FokI con una serie de proteínas de unión al ADN o matrices de dedos de zinc, denominadas nucleasas con dedos de zinc (ZFN), son una herramienta poderosa para la edición del genoma del huésped debido a su especificidad de secuencia mejorada. Las ZFN funcionan en pares, y su dimerización está mediada in situ a través del dominio FokI. Cada matriz de dedos de zinc (ZFA) es capaz de reconocer de 9 a 12 pares de bases, lo que equivale a 18 a 24 para el par. Un espaciador de 5 a 7 pb entre los sitios de escisión mejora aún más la especificidad de ZFN, lo que los convierte en una herramienta segura y más precisa que se puede aplicar en humanos. Recientemente se ha llevado a cabo un ensayo clínico de fase I de ZFN para la abolición selectiva del correceptor CCR5 del VIH-1. [69]
Otros han propuesto utilizar el sistema RM de bacterias como modelo para diseñar vacunas y terapias genéticas o genómicas antivirales humanas, ya que el sistema RM cumple una función de defensa innata en las bacterias al restringir el tropismo de los bacteriófagos. [70] Hay investigaciones sobre REases y ZFN que pueden escindir el ADN de varios virus humanos, incluidos HSV-2 , HPV de alto riesgo y VIH-1 , con el objetivo final de inducir mutagénesis objetivo y aberraciones de virus que infectan a humanos. [71] [72] [73] El genoma humano ya contiene restos de genomas retrovirales que han sido inactivados y aprovechados para el beneficio personal. De hecho, los mecanismos para silenciar los retroelementos genómicos L1 activos mediante las tres exonucleasas de reparación principal 1 (TREX1) y el complemento cruzado de reparación por escisión 1 (ERCC) parecen imitar la acción de los sistemas RM en bacterias y la unión de extremos no homólogos ( NHEJ) que sigue el uso de ZFN sin plantilla de reparación. [74] [75]
Ejemplos de enzimas de restricción incluyen: [76]
Clave:
* = extremos romos
N = C o G o T o A
W = A o T
para el descubrimiento de enzimas de restricción y su aplicación a problemas de genética molecular
Base de datos de enzimas de restricción.