El sistema de modificación de restricción ( sistema RM ) se encuentra en bacterias y arqueas y proporciona una defensa contra el ADN extraño , como el que transportan los bacteriófagos .
Las bacterias tienen enzimas de restricción , también llamadas endonucleasas de restricción , que escinden el ADN bicatenario en puntos específicos en fragmentos, que luego son degradados aún más por otras endonucleasas . Esto previene la infección al destruir eficazmente el ADN extraño introducido por un agente infeccioso (como un bacteriófago ). Aproximadamente una cuarta parte de las bacterias conocidas poseen sistemas RM y de ellas, aproximadamente la mitad tiene más de un tipo de sistema.
Como las secuencias reconocidas por las enzimas de restricción son muy cortas, es casi seguro que la propia bacteria contendrá algunas dentro de su genoma. Para evitar la destrucción del propio ADN por las enzimas de restricción, se añaden grupos metilo . Estas modificaciones no deben interferir con el emparejamiento de bases del ADN y, por lo tanto, normalmente sólo se modifican unas pocas bases específicas en cada cadena.
Las endonucleasas escinden enlaces fosfodiéster internos/no terminales. Lo hacen sólo después de reconocer secuencias específicas en el ADN que suelen tener entre 4 y 6 pares de bases de largo y, a menudo, palindrómicas .
El sistema RM fue descubierto por primera vez por Salvatore Luria y Mary Human en 1952 y 1953. [1] [2] Descubrieron que un bacteriófago que crecía dentro de una bacteria infectada podía modificarse, de modo que, tras su liberación y reinfección, una bacteria relacionada el crecimiento del bacteriófago está restringido (inhibido; también descrito por Luria en su autobiografía en las páginas 45 y 99 en 1984). [3] En 1953, Jean Weigle y Giuseppe Bertani informaron ejemplos similares de modificación controlada por el huésped utilizando diferentes sistemas de bacteriófagos. [4] El trabajo posterior de Daisy Roulland-Dussoix y Werner Arber en 1962 [5] y muchos otros trabajadores posteriores llevaron a la comprensión de que la restricción se debía al ataque y descomposición del ADN del bacteriófago modificado por enzimas específicas de la bacteria receptora. Un trabajo adicional de Hamilton O. Smith aisló HinDII, la primera de la clase de enzimas ahora conocidas como enzimas de restricción , mientras que Daniel Nathans demostró que puede usarse para mapeo de restricción . [6] Cuando estas enzimas se aislaron en el laboratorio, pudieron usarse para la manipulación controlada del ADN, proporcionando así la base para el desarrollo de la ingeniería genética . Werner Arber, Daniel Nathans y Hamilton Smith recibieron el Premio Nobel de Fisiología o Medicina en 1978 por su trabajo sobre la modificación de restricciones. [ cita necesaria ]
Hay cuatro categorías de sistemas de modificación de restricciones: tipo I, tipo II, tipo III y tipo IV. [7] Todos tienen actividad de enzima de restricción y actividad metilasa (excepto el tipo IV que no tiene actividad metilasa). Fueron nombrados por orden de descubrimiento, aunque el sistema de tipo II es el más común. [7]
Los sistemas de tipo I son los más complejos y constan de tres polipéptidos: R (restricción), M (modificación) y S (especificidad). El complejo resultante puede escindir y metilar el ADN. Ambas reacciones requieren ATP y la escisión suele ocurrir a una distancia considerable del sitio de reconocimiento. La subunidad S determina la especificidad tanto de la restricción como de la metilación. La escisión se produce a distancias variables de la secuencia de reconocimiento, por lo que las bandas discretas no se visualizan fácilmente mediante electroforesis en gel . [ cita necesaria ]
Los sistemas de tipo II son los más simples y los más frecuentes. [8] En lugar de funcionar como un complejo, la metiltransferasa y la endonucleasa están codificadas como dos proteínas separadas y actúan de forma independiente (no existe una proteína específica). Ambas proteínas reconocen el mismo sitio de reconocimiento y, por tanto, compiten por la actividad. La metiltransferasa actúa como monómero , metilando el dúplex una hebra a la vez. La endonucleasa actúa como homodímero , lo que facilita la escisión de ambas hebras. La escisión se produce en una posición definida cerca o dentro de la secuencia de reconocimiento, produciendo así fragmentos discretos durante la electroforesis en gel. Por este motivo, los sistemas de tipo II se utilizan en laboratorios para análisis de ADN y clonación de genes . [ cita necesaria ]
Los sistemas tipo III tienen proteínas R (res) y M (mod) que forman un complejo de modificación y escisión. La proteína M, sin embargo, puede metilarse por sí sola. Además, la metilación sólo se produce en una hebra del ADN, a diferencia de la mayoría de los otros mecanismos conocidos. El heterodímero formado por las proteínas R y M compite consigo mismo modificando y restringiendo la misma reacción. Esto resulta en una digestión incompleta. [9] [10]
Los sistemas de tipo IV no son verdaderos sistemas RM porque solo contienen una enzima de restricción y no una metilasa. A diferencia de los otros tipos, las enzimas de restricción de tipo IV reconocen y cortan sólo el ADN modificado. [11]
Neisseria meningitidis tiene múltiples sistemas de endonucleasas de restricción de tipo II que se emplean en la transformación genética natural . La transformación genética natural es un proceso mediante el cual una célula bacteriana receptora puede tomar ADN de una célula bacteriana donante vecina e integrar este ADN en su genoma mediante recombinación. Aunque los primeros trabajos sobre sistemas de modificación de restricción se centraron en el beneficio para las bacterias de protegerse contra el ADN de bacteriófagos invasores u otro ADN extraño, ahora se sabe que estos sistemas también pueden usarse para restringir el ADN introducido por transformación natural de otros miembros del mismo. o especies relacionadas. [ cita necesaria ]
En la bacteria patógena Neisseria meningitidis (meningococos), la competencia para la transformación es un proceso complejo y altamente evolucionado en el que múltiples proteínas en la superficie bacteriana, en las membranas y en el citoplasma interactúan con el ADN transformador entrante. Los sistemas de modificación de restricción son abundantes en el género Neisseria . N. meningitidis tiene múltiples sistemas de endonucleasas de restricción de tipo II. [12] Los sistemas de modificación de restricción en N. meningitidis varían en especificidad entre diferentes clados. [12] [13] Esta especificidad proporciona una barrera eficaz contra el intercambio de ADN entre clados. [12] Luria, en la página 99 de su autobiografía, [3] se refirió a tal comportamiento de restricción como "un ejemplo extremo de hostilidad". La modificación de la restricción parece ser un factor importante del aislamiento sexual y la especiación en los meningococos. [14] Caugant y Maiden [15] sugirieron que los sistemas de modificación de restricción en meningococos pueden actuar para permitir el intercambio genético entre parientes muy cercanos y al mismo tiempo reducir (pero no prevenir por completo) el intercambio genético entre meningococos que pertenecen a diferentes complejos clonales y especies relacionadas. [ cita necesaria ]
Los sistemas RM también pueden actuar como elementos genéticos egoístas , forzando su mantenimiento en la célula mediante la muerte celular postsgregacional. [16]
Algunos virus han desarrollado formas de subvertir el sistema de modificación de restricción, generalmente modificando su propio ADN, añadiéndole grupos metilo o glicosilo , bloqueando así las enzimas de restricción. Otros virus, como los bacteriófagos T3 y T7, codifican proteínas que inhiben las enzimas de restricción. [ cita necesaria ]
Para contrarrestar estos virus, algunas bacterias han desarrollado sistemas de restricción que sólo reconocen y escinden el ADN modificado, pero no actúan sobre el ADN no modificado del huésped. Algunos procariotas han desarrollado múltiples tipos de sistemas de modificación de restricciones. [ cita necesaria ]
Los sistemas de RM son más abundantes en especies promiscuas, en las que establecen rutas preferenciales de intercambio genético dentro y entre linajes con sistemas de RM afines. [17] Debido a que el repertorio y/o la especificidad de los sistemas de RM en linajes bacterianos varían rápidamente, se espera que los flujos preferenciales de transferencia genética dentro de las especies cambien constantemente, produciendo redes de transferencia de genes dependientes del tiempo. [ cita necesaria ]
(a) Clonación: los sistemas RM pueden clonarse en plásmidos y seleccionarse debido a la resistencia proporcionada por la enzima de metilación. Una vez que el plásmido comienza a replicarse, se producirá la enzima de metilación y metilará el ADN del plásmido, protegiéndolo de una enzima de restricción específica. [ cita necesaria ]
(b) Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción: las enzimas de restricción también se utilizan para analizar la composición del ADN con respecto a la presencia o ausencia de mutaciones que afectan la especificidad de escisión de REase. Cuando los tipos salvajes y los mutantes se analizan mediante digestión con diferentes REasas, los productos electroforéticos en gel varían en longitud, en gran parte porque los genes mutantes no se escindirán en un patrón similar al de los tipos salvajes para detectar la presencia de mutaciones que hacen que las REasas no sean específicas. a la secuencia mutante. [ cita necesaria ]
El sistema RM de bacterias se ha propuesto como modelo para diseñar vacunas y terapias genéticas o genómicas antivirales humanas, ya que el sistema RM cumple una función de defensa innata en las bacterias al restringir el tropismo de los bacteriófagos. [18] Se están investigando REases y ZFN que pueden escindir el ADN de varios virus humanos, incluidos HSV-2 , HPV de alto riesgo y VIH-1 , con el objetivo final de inducir mutagénesis objetivo y aberraciones de virus que infectan a humanos. [19] [20] [21] El genoma humano ya contiene restos de genomas retrovirales que han sido inactivados y aprovechados para el beneficio personal. De hecho, los mecanismos para silenciar los retroelementos genómicos L1 activos mediante las tres exonucleasas de reparación principal 1 (TREX1) y el complemento cruzado de reparación por escisión 1 (ERCC) parecen imitar la acción de los sistemas RM en bacterias y la unión de extremos no homólogos ( NHEJ) que sigue el uso de ZFN sin plantilla de reparación. [22] [23]
Un avance importante es la creación de enzimas de restricción artificiales creadas uniendo el dominio de escisión del ADN FokI con una serie de proteínas de unión al ADN o matrices de dedos de zinc, denominadas ahora nucleasas con dedos de zinc (ZFN). [24] Las ZFN son una herramienta poderosa para la edición del genoma del huésped debido a su especificidad de secuencia mejorada. ZFN funciona en pares, y su dimerización está mediada in situ a través del dominio FoKI. Cada matriz de dedos de zinc (ZFA) es capaz de reconocer de 9 a 12 pares de bases, lo que equivale a 18 a 24 para el par. Un espaciador de 5 a 7 pb entre los sitios de escisión mejora aún más la especificidad de ZFN, lo que los convierte en una herramienta segura y más precisa que se puede aplicar en humanos. Recientemente se ha llevado a cabo un ensayo clínico de fase I de ZFN para la abolición selectiva del correceptor CCR5 del VIH-1. [25]
Los sistemas RM son actores importantes en la interacción coevolutiva entre los elementos genéticos móviles (MGEs) y sus huéspedes. [26] Se ha informado que los genes que codifican sistemas RM se mueven entre genomas procarióticos dentro de MGE, como plásmidos, profagos, secuencias de inserción/transposones, elementos conjugativos integrativos (ICE) e integrones. Sin embargo, recientemente se descubrió que existen relativamente pocos sistemas RM en los plásmidos, algunos en los profagos y prácticamente ninguno en los fagos. Por otro lado, todos estos MGE codifican un gran número de genes RM solitarios, en particular MTasas. [26] A la luz de esto, es probable que la movilidad de RM sea menos dependiente de los MGE y más dependiente, por ejemplo, de la existencia de pequeños puntos críticos de integración genómica. También es posible que los sistemas de RM exploten con frecuencia otros mecanismos como la transformación natural, vesículas, nanotubos, agentes de transferencia de genes o transducción generalizada para moverse entre genomas. [ cita necesaria ]