Un mapa de restricción es un mapa de sitios de restricción conocidos dentro de una secuencia de ADN . El mapeo de restricción requiere el uso de enzimas de restricción . En biología molecular , los mapas de restricción se utilizan como referencia para diseñar plásmidos u otras piezas de ADN relativamente cortas y, a veces, para ADN genómico más largo. Hay otras formas de mapear características del ADN para moléculas de ADN de mayor longitud, como el mapeo por transducción . [1]
Un enfoque para construir un mapa de restricción de una molécula de ADN es secuenciar la molécula completa y ejecutar la secuencia a través de un programa de computadora que encontrará los sitios de reconocimiento que están presentes para cada enzima de restricción conocida.
Antes de que se automatizara la secuenciación, habría sido prohibitivamente costoso secuenciar una cadena de ADN completa. Para encontrar las posiciones relativas de los sitios de restricción en un plásmido, se utiliza una técnica que implica digestiones de restricción simples y dobles. A partir de los tamaños de los fragmentos de ADN resultantes se pueden inferir las posiciones de los sitios. El mapeo de restricción es una técnica muy útil cuando se usa para determinar la orientación de un inserto en un vector de clonación, mapeando la posición de un sitio de restricción descentrado en el inserto. [2]
El procedimiento experimental requiere primero una muestra de ADN plasmídico purificado para cada digestión que se va a ejecutar. Luego se realiza la digestión con cada enzima elegida. Posteriormente, las muestras resultantes se procesan en un gel de electroforesis , normalmente en gel de agarosa .
El primer paso tras finalizar la electroforesis es sumar los tamaños de los fragmentos en cada carril. La suma de los fragmentos individuales debe ser igual al tamaño del fragmento original, y los fragmentos de cada resumen también deben sumar el mismo tamaño entre sí. Si los tamaños de los fragmentos no cuadran correctamente, es posible que existan dos problemas. En un caso, es posible que algunos de los fragmentos más pequeños se hayan salido del extremo del gel. Esto ocurre frecuentemente si el gel se deja actuar por mucho tiempo. Una segunda posible fuente de error es que el gel no era lo suficientemente denso y, por lo tanto, no pudo resolver fragmentos de tamaño similar. Esto conduce a una falta de separación de fragmentos de tamaño similar. Si todos los resúmenes producen fragmentos que se suman, se puede inferir la posición de los sitios REN (endonucleasa de restricción) colocándolos en lugares en el fragmento de ADN original que satisfarían los tamaños de fragmentos producidos por los tres resúmenes.
En esta técnica las células se lisan en condiciones alcalinas. El ADN de la mezcla se desnaturaliza (se separan las hebras) rompiendo los enlaces de hidrógeno entre las dos hebras. El gran ADN genómico está sujeto a enredarse y permanecer desnaturalizado cuando se reduce el pH durante la neutralización. En otras palabras, las hebras se vuelven a juntar de forma desordenada, formando pares de bases al azar. Las hebras de los plásmidos circulares superenrollados permanecerán relativamente alineadas y se renaturalizarán correctamente. Por tanto, el ADN genómico formará un agregado insoluble y los plásmidos superenrollados quedarán en solución. A esto le puede seguir una extracción con fenol para eliminar proteínas y otras moléculas. Luego, el ADN se puede someter a precipitación con etanol para concentrar la muestra.