La precipitación con etanol es un método utilizado para purificar y/o concentrar ARN , ADN y polisacáridos como pectina y xiloglucano a partir de soluciones acuosas agregando etanol como antidisolvente.
El ADN es polar debido a su estructura de fosfato altamente cargada . Su polaridad lo hace soluble en agua (el agua es polar) de acuerdo con el principio "lo similar disuelve a lo similar" .
Debido a la alta polaridad del agua, ilustrada por su alta constante dieléctrica de 80,1 (a 20 °C), las fuerzas electrostáticas entre partículas cargadas son considerablemente menores en solución acuosa que en el vacío o en el aire.
Esta relación se refleja en la ley de Coulomb , que puede utilizarse para calcular la fuerza que actúa sobre dos cargas separadas por una distancia utilizando la constante dieléctrica (también llamada permitividad estática relativa) del medio en el denominador de la ecuación ( es una constante eléctrica ):
A nivel atómico, la reducción de la fuerza que actúa sobre una carga se debe a que las moléculas de agua forman una capa de hidratación a su alrededor. Este hecho hace que el agua sea un disolvente muy bueno para compuestos cargados como las sales. La fuerza eléctrica que normalmente mantiene unidos los cristales de sal mediante enlaces iónicos se debilita en presencia de agua, lo que permite que los iones se separen del cristal y se dispersen por la solución.
El mismo mecanismo opera en el caso de grupos fosfato cargados negativamente en la cadena principal de ADN: aunque hay iones positivos presentes en la solución, la fuerza electrostática neta relativamente débil les impide formar enlaces iónicos estables con fosfatos y precipitarse fuera de la solución.
El etanol es mucho menos polar que el agua, con una constante dieléctrica de 24,3 (a 25 °C). Esto significa que añadir etanol a la solución altera el filtrado de cargas por parte del agua. Si se añade suficiente etanol, la atracción eléctrica entre los grupos fosfato y los iones positivos presentes en la solución se vuelve lo suficientemente fuerte como para formar enlaces iónicos estables y la precipitación del ADN. Esto suele ocurrir cuando el etanol compone más del 64 % de la solución. Como sugiere el mecanismo, la solución tiene que contener iones positivos para que se produzca la precipitación; normalmente, este papel lo desempeñan Na + , NH4 + o Li + . [1]
El ADN se precipita asegurándose primero de que la concentración correcta de iones positivos esté presente en la solución (demasiado resultará en mucha coprecipitación de sal con el ADN, muy poco resultará en una recuperación incompleta del ADN) y luego agregando dos a tres volúmenes de al menos 95% de etanol. Muchos protocolos recomiendan almacenar el ADN a baja temperatura en este punto, pero también hay observaciones de que puede no mejorar la recuperación del ADN e incluso puede reducir la eficiencia de la precipitación mientras se usa el tiempo de incubación durante la noche. [2] [3] Por lo tanto, se puede lograr una buena eficiencia a temperatura ambiente, pero cuando se tiene en cuenta la posible degradación, probablemente sea mejor incubar el ADN en hielo húmedo. El tiempo de incubación óptimo depende de la longitud y la concentración del ADN. Los fragmentos más pequeños y las concentraciones más bajas requerirán tiempos más largos para lograr una recuperación aceptable. Para longitudes muy pequeñas y concentraciones bajas, se recomienda la incubación durante la noche. En tales casos, el uso de portadores como ARNt , glucógeno o poliacrilamida lineal puede mejorar en gran medida la recuperación.
Durante la incubación, el ADN y algunas sales precipitarán de la solución; en el siguiente paso, este precipitado se recoge por centrifugación en un tubo de microcentrífuga a altas velocidades (~12 000 g ). El tiempo y la velocidad de centrifugación tienen el mayor efecto en las tasas de recuperación de ADN. Nuevamente, los fragmentos más pequeños y las diluciones más altas requieren una centrifugación más larga y rápida. La centrifugación se puede realizar a temperatura ambiente o a 4 °C o 0 °C. Durante la centrifugación, el ADN precipitado tiene que moverse a través de la solución de etanol hasta el fondo del tubo; las temperaturas más bajas aumentan la viscosidad de la solución y los volúmenes más grandes hacen que la distancia sea más larga, por lo que ambos factores reducen la eficiencia de este proceso y requieren una centrifugación más larga para el mismo efecto. [2] [3] Después de la centrifugación, se elimina la solución sobrenadante, dejando un pellet de ADN crudo. Si el pellet es visible depende de la cantidad de ADN y de su pureza (los pellets más sucios son más fáciles de ver) o del uso de coprecipitantes.
En el siguiente paso, se añade etanol al 70 % al pellet y se mezcla suavemente para desmoldarlo y lavarlo. Esto elimina algunas de las sales presentes en el sobrenadante sobrante y unidas al pellet de ADN, lo que hace que el ADN sea el limpiador final. Esta suspensión se centrifuga nuevamente para volver a sedimentar el ADN y se elimina la solución sobrenadante. Este paso se repite una vez.
Por último, el pellet se seca al aire y el ADN se resuspende en agua u otro tampón deseado . Es importante no secar demasiado el pellet, ya que puede provocar la desnaturalización del ADN y dificultar su resuspensión.
También se puede utilizar isopropanol en lugar de etanol; la eficiencia de precipitación del isopropanol es mayor, por lo que un volumen es suficiente para la precipitación. Sin embargo, el isopropanol es menos volátil que el etanol y necesita más tiempo para secarse al aire en el paso final. El pellet también puede adherirse con menos fuerza al tubo cuando se utiliza isopropanol. [1]
