"Estructura cristalina de I-CreI unida a su secuencia de reconocimiento de ADN ". La enzima se une como un homodímero; una subunidad está representada en amarillo y la otra en rosa. La enzima se muestra en representación de superficie; La molécula de ADN se muestra como una colección de esferas, cada una coloreada según su elemento químico .
Las endonucleasas homing son un conjunto de endonucleasas codificadas como genes independientes dentro de intrones , como fusiones con proteínas del huésped o como inteínas que se autoempalman . Catalizan la hidrólisis del ADN genómico dentro de las células que los sintetizan, pero lo hacen en muy pocos lugares, o incluso singulares. La reparación del ADN hidrolizado por la célula huésped frecuentemente da como resultado que el gen que codifica la endonucleasa de localización se haya copiado en el sitio de escisión, de ahí el término "localización" para describir el movimiento de estos genes. De este modo, las endonucleasas homing pueden transmitir sus genes horizontalmente dentro de una población huésped, aumentando la frecuencia de sus alelos a tasas mayores que las mendelianas.
Origen y mecanismo
Aunque aún se investiga el origen y función de las endonucleasas homing, la hipótesis más establecida las considera como elementos genéticos egoístas , [1] similares a los transposones , porque facilitan la perpetuación de los elementos genéticos que las codifican independientemente de proporcionar un atributo funcional a el organismo huésped.
Las secuencias de reconocimiento de endonucleasas localizadas son lo suficientemente largas como para ocurrir aleatoriamente sólo con una probabilidad muy baja (aproximadamente una vez cada7 × 10 9 pb ), [2] y normalmente se encuentran en uno o muy pocos casos por genoma . Generalmente, debido al mecanismo de localización, el gen que codifica la endonucleasa (el HEG, "gen de la endonucleasa de localización") está situado dentro de la secuencia de reconocimiento que corta la enzima, interrumpiendo así la secuencia de reconocimiento de la endonucleasa de localización y limitando el corte del ADN sólo a sitios que no lo hacen. no lleva (todavía) el HEG.
Antes de la transmisión, un alelo porta el gen (HEG + ) mientras que el otro no (HEG − ) y, por lo tanto, es susceptible de ser cortado por la enzima. Una vez que se sintetiza la enzima, rompe el cromosoma en el alelo HEG- , iniciando una respuesta del sistema de reparación del ADN celular . El daño se repara mediante recombinación , tomando el patrón del alelo de ADN opuesto y no dañado, HEG + , que contiene el gen de la endonucleasa. Así, el gen se copia al alelo que inicialmente no lo tenía y se propaga a través de sucesivas generaciones. [3] Este proceso se llama "homing". [3]
Nomenclatura
Las endonucleasas homing siempre se indican con un prefijo que identifica su origen genómico, seguido de un guión: "I-" para las endonucleasas homing codificadas dentro de un intrón, "PI-" (para "inserto de proteína") para aquellas codificadas dentro de una inteína. Algunos autores han propuesto utilizar el prefijo "F-" ("independiente") para enzimas virales y otras enzimas naturales no codificadas por intrones ni inteínas, [4] y "H-" ("híbrido") para enzimas sintetizadas en un laboratorio. [5] A continuación, un nombre de tres letras se deriva del nombre binominal del organismo, tomando una letra mayúscula del nombre del género y dos letras minúsculas del nombre específico . (Por lo general, se realizan algunas mezclas para las enzimas híbridas). Finalmente, un número romano distingue diferentes enzimas que se encuentran en el mismo organismo:
PI-TliII ( P30317 ) es la segunda enzima identificada codificada por una inteína que se encuentra en la arquea Thermococcus litoralis . [6] [7] [8]
H-DreI ( PDB : 1MOW ) es la primera endonucleasa homing sintética, creada en un laboratorio a partir de las enzimas I-DmoI ( P21505 ) e I-CreI ( P05725 ), extraídas respectivamente de Desulfurococcus mobilis y Chlamydomonas reinhardtii . [5] [9]
Las endonucleasas homing son generalmente más tolerantes a las sustituciones en la secuencia de reconocimiento. Las variaciones menores en la secuencia de reconocimiento generalmente disminuyen la actividad de las endonucleasas homing, pero a menudo no la eliminan por completo, como suele ocurrir con las enzimas de restricción. [10] [11]
Las endonucleasas homing comparten motivos estructurales que sugieren que hay cuatro familias, mientras que no ha sido posible determinar familias simplemente reconocibles y distinguibles de enzimas de restricción de tipo II.
Las endonucleasas homing actúan como monómeros u homodímeros y, a menudo, requieren proteínas asociadas para regular su actividad [12] o formar complejos de ribonucleoproteínas , en los que el ARN es un componente integral del aparato catalítico. [13] Las enzimas de restricción de tipo II también pueden funcionar solas, como monómeros u homodímeros, [14] o con subunidades proteicas adicionales , [15] pero las subunidades accesorias difieren de las de las endonucleasas homing. Por tanto, pueden requerir subunidades de restricción, modificación y especificidad para su acción. [15]
Finalmente, las endonucleasas homing tienen una distribución filogenética más amplia y se presentan en los tres dominios biológicos : las arqueas , las bacterias y los eukarya . Las enzimas de restricción de tipo II se encuentran sólo en arqueas, bacterias y ciertos virus. [16] [17] [18] Las endonucleasas dirigidas también se expresan en los tres compartimentos de la célula eucariota: núcleos , mitocondrias y cloroplastos . Se han encontrado marcos de lectura abiertos que codifican endonucleasas dirigidas en intrones , inteínas y en forma independiente entre genes, mientras que los genes que codifican genes de enzimas de restricción de tipo II se han encontrado solo en forma independiente, casi siempre en estrecha asociación con genes que codifican enzimas modificadoras del ADN afines. [19] Por lo tanto, si bien las enzimas de restricción de tipo II y las endonucleasas homing comparten la función de escindir el ADN bicatenario, parecen haber evolucionado de forma independiente.
Familias estructurales
Actualmente hay seis familias estructurales conocidas. Sus motivos estructurales conservados son: [4]
LAGLIDADG: Cada polipéptido tiene 1 o 2 motivos LAGLIDADG. La secuencia LAGLIDADG es una secuencia conservada de aminoácidos donde cada letra es un código que identifica un residuo específico. Esta secuencia está directamente involucrada en el proceso de corte del ADN. Aquellas enzimas que tienen un solo motivo funcionan como homodímeros, creando una silla que interactúa con el surco principal de cada medio sitio del ADN. Los motivos LAGLIDADG aportan residuos de aminoácidos tanto a la interfaz proteína-proteína entre dominios o subunidades de proteínas como a los sitios activos de la enzima. Las enzimas que poseen dos motivos en una sola cadena proteica actúan como monómeros, creando la silla de montar de manera similar. Las primeras estructuras que se determinaron de endonucleasas homing (de PI-SceI e I-CreI, ambas reportadas en 1997) fueron ambas de la familia estructural LAGLIDADG. [20] [21] Al año siguiente, la primera estructura de una endonucleasa homing (I-CreI) unida a su sitio objetivo de ADN. [9]
GIY-YIG: Tienen un solo motivo GIY-YIG, en la región N-terminal , que interactúa con el ADN en el sitio de corte. La enzima prototípica de esta familia es I-TevI que actúa como monómero. Se han informado estudios estructurales separados de los dominios catalíticos y de unión al ADN de I-TevI, el primero unido a su objetivo de ADN y el segundo en ausencia de ADN. [22] [23]
Caja His-Cys ( Pfam PF05551): Estas enzimas poseen una región de 30 aminoácidos que incluye 5 residuos conservados: dos histidinas y tres cisteínas . Coordinan el catión metálico necesario para la catálisis . I-PpoI es la enzima mejor caracterizada de esta familia y actúa como un homodímero. Su estructura fue reportada en 1998. [24] Posiblemente esté relacionado con la familia HNH, ya que comparten características comunes. [25]
HNH: ( Pfam CL0263): Tienen una secuencia consenso de aproximadamente 30 aminoácidos. Incluye dos pares de histidinas conservadas y una asparagina que crean un dominio de dedos de zinc . I-HmuI ( P34081 ) es la enzima mejor caracterizada de esta familia y actúa como un monómero. Su estructura fue reportada en 2004 ( PDB : 1U3E ). [26]
PD-(D/E)xK ( Pfam CL0236): estas enzimas contienen un dominio catalítico de nucleasa canónica que normalmente se encuentra en las endonucleasas de restricción de tipo II. La enzima mejor caracterizada de esta familia, I-Ssp6803I ( Q57253 ), actúa como tetrámero. Su estructura fue reportada en 2007 ( PDB : 2OST ). [27] El pliegue general se conserva en muchas familias de endonucleasas, todas las cuales pertenecen a la superfamilia PD-(D/E)xK. [28]
Vsr-like/EDxHD (DUF559, InterPro : IPR007569 ): estas enzimas se descubrieron en la base de datos metagenómica de muestreo oceánico global y se describieron por primera vez en 2009. El término "Vsr-like" se refiere a la presencia de un dominio de nucleasa C-terminal que muestra homología reconocible con las endonucleasas bacterianas de reparación de parches muy cortos (Vsr). [29] La estructura se resolvió en 2011, confirmando la homología Vsr. [30] Se considera parte de la superfamilia PD-(D/E)xk. [28]
Arquitectura de dominio
La endonucleasa de levadura PI-Sce es una endonucleasa de tipo LAGLIDADG codificada como una inteína que se separa de otra proteína ( P17255 ). La estructura de alta resolución revela dos dominios : un centro endonucleolítico que se asemeja al dominio C-terminal de las proteínas Hedgehog y un dominio Hint (Hedgehog/Intein) que contiene el sitio activo de empalme de proteínas . [31]
Ver también
REBASE , una base de datos completa sobre enzimas de restricción de New England Biolabs con enlaces a literatura relacionada.
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Enlaces externos
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