La clonación Golden Gate o ensamblaje Golden Gate [1] es un método de clonación molecular que permite a un investigador ensamblar de manera simultánea y direccional múltiples fragmentos de ADN en una sola pieza utilizando enzimas de restricción de tipo IIS y la ADN ligasa T4 . [2] Este ensamblaje se realiza in vitro . Las enzimas de tipo IIS más utilizadas incluyen BsaI, BsmBI y BbsI.
A diferencia de las enzimas de restricción de tipo II estándar como EcoRI y BamHI , estas enzimas cortan el ADN fuera de sus sitios de reconocimiento y, por lo tanto, pueden crear salientes no palindrómicos . [3] Dado que son posibles 256 secuencias salientes potenciales, se pueden ensamblar múltiples fragmentos de ADN utilizando combinaciones de secuencias salientes. [3] En la práctica, esto significa que la clonación Golden Gate normalmente no deja cicatrices. Además, debido a que el producto final no tiene un sitio de reconocimiento de enzima de restricción de tipo IIS, el producto correctamente ligado no puede ser cortado nuevamente por la enzima de restricción, lo que significa que la reacción es esencialmente irreversible. [3] Esto tiene múltiples beneficios, el primero es que es posible hacer la digestión y ligadura de los fragmentos de ADN en una sola reacción, en contraste con los métodos de clonación convencionales donde estas reacciones son separadas. El segundo es una mayor eficiencia [1] porque el producto final no puede ser cortado nuevamente por la enzima de restricción.
Un protocolo típico de termociclador oscila entre 37 °C (óptimo para enzimas de restricción) y 16 °C (óptimo para ligasas) muchas veces. [4] Si bien esta técnica se puede utilizar para un solo inserto, los investigadores han utilizado la clonación Golden Gate para ensamblar muchas piezas de ADN simultáneamente. [5]
Las secuencias de cicatriz son comunes en el ensamblaje de ADN de múltiples segmentos. En el método de ensamblaje de múltiples segmentos Gateway , se agregan segmentos al donante con secuencias ATT adicionales, que se superponen en esos segmentos agregados, y esto da como resultado segmentos separados por las secuencias ATT. [6] En el ensamblaje BioBrick , una secuencia de cicatriz de ocho nucleótidos, que codifica una tirosina y un codón de terminación , se deja entre cada segmento agregado al plásmido. [6]
El ensamblaje de Golden Gate utiliza enzimas de restricción de tipo IIS que cortan fuera de sus secuencias de reconocimiento. [6] Además, la misma enzima de restricción de tipo IIS puede generar abundantes salientes diferentes en los insertos y el vector; por ejemplo, BsaI crea 256 salientes de cuatro pares de bases. [6] Si los salientes se diseñan cuidadosamente, los segmentos se ligan sin secuencias de cicatriz entre ellos, y la construcción final puede ser casi sin cicatrices, donde los sitios de enzimas de restricción permanecen en ambos lados del inserto. [6] Como se pueden insertar segmentos adicionales en los vectores sin cicatrices dentro de un marco de lectura abierto , Golden Gate se usa ampliamente en ingeniería de proteínas . [6]
Aunque la clonación Golden Gate acelera la clonación multisegmento, se requiere un diseño cuidadoso de los plásmidos donantes y receptores. [5] Los científicos de New England Biolabs han demostrado con éxito el ensamblaje de 35 fragmentos a través de una reacción de ensamblaje Golden Gate de un solo tubo. [7] Crítico para este método de ensamblaje, la estructura del vector del plásmido de destino y todos los fragmentos de ensamblaje están flanqueados por sitios de reconocimiento de enzimas de restricción de tipo IIS, ya que este subtipo de enzimas de restricción cortan aguas abajo de sus sitios de reconocimiento . Después del corte, cada pieza de ADN activa del ensamblaje tiene salientes únicos que se unen al siguiente fragmento de ADN en el ensamblaje planificado y se ligan, construyendo el ensamblaje. Si bien también es posible que un saliente se vuelva a unir a su saliente complementario original asociado con el sitio de reconocimiento aguas arriba y se ligue, reformando la secuencia original, esto será susceptible de cortes adicionales a lo largo de la reacción de ensamblaje.
El ensamblaje de ADN con enzimas de restricción tiene estándares de clonación para minimizar el cambio en la eficiencia de clonación y la función del plásmido, que puede ser causado por la compatibilidad de los sitios de restricción en el inserto y aquellos en el vector. [8]
Los estándares de clonación del ensamblaje Golden Gate tienen dos niveles. [8] El ensamblaje Golden Gate de primer nivel construye la construcción de un solo gen agregando elementos genéticos como el promotor, los marcos de lectura abiertos y los terminadores. [8] Luego, el ensamblaje Golden Gate de segundo nivel combina varias construcciones realizadas en el ensamblaje de primer nivel para hacer una construcción multigénica. [8] Para lograr el ensamblaje de segundo nivel, se utilizan el sistema de clonación modular (MoClo) y el estándar GoldenBraid2.0. [8]
La clonación modular, o MoClo, es un método de ensamblaje introducido en 2011 por Ernst Weber et al., mediante el cual, utilizando sitios de restricción de tipo IIS, el usuario puede ligar al menos seis partes de ADN juntas en una cadena principal en una reacción de un solo paso. Es un método basado en el ensamblaje Golden Gate, donde las enzimas de restricción de tipo IIS cortan fuera de su sitio de reconocimiento hacia un lado, lo que permite la eliminación de esos sitios de restricción del diseño. Esto ayuda a eliminar el exceso de pares de bases, o cicatrices, que se forman entre las partes de ADN. Sin embargo, para ligar correctamente, MoClo utiliza un conjunto de sitios de fusión de 4 pares de bases, que permanecen entre las partes después de la ligadura, formando cicatrices de 4 pares de bases entre las partes de ADN en la secuencia de ADN final después de la ligadura de dos o más partes. [9]
MoClo utiliza un enfoque paralelo, donde todos los constructos de nivel uno (módulos de nivel 0) tienen sitios de restricción para BpiI en ambos lados de los insertos. El vector (también conocido como "vector de destino"), donde se añadirán los genes, tiene un sitio de restricción BsaI orientado hacia afuera con un casete de detección de abandono. [8] LacZ es un casete de detección común, donde se reemplaza por el constructo multigénico en el vector de destino. [8] Cada constructo de nivel uno y el vector tienen diferentes salientes en ellos pero complementarios al saliente del siguiente segmento, y esto determina el diseño del constructo multigénico final. [8] La clonación Golden Gate generalmente comienza con módulos de nivel 0. [5] Sin embargo, si el módulo de nivel 0 es demasiado grande, la clonación comenzará a partir de fragmentos de nivel -1, que deben secuenciarse, para ayudar a clonar el constructo grande. [5] Si se comienza desde fragmentos de nivel -1, no es necesario volver a secuenciar los módulos de nivel 0, mientras que si se comienza desde módulos de nivel 0, es necesario secuenciarlos. [5]
Los módulos de nivel 0 son la base del sistema MoClo, donde contienen elementos genéticos como un promotor, una región no traducida 5' (UTR), una secuencia codificante y un terminador. [5] Para el propósito de la clonación Golden Gate, las secuencias internas de los módulos de nivel 0 no deben contener sitios de enzimas de restricción de tipo IIS para BsaI, BpiI y Esp3I mientras estén rodeadas por dos sitios de restricción BsaI en orientación invertida. [5] Los módulos de nivel 0 sin sitios de restricción de tipo IIS flanqueando pueden agregar los sitios BsaI durante el proceso de clonación Golden Gate. [5]
Si los módulos de nivel 0 contienen algún sitio de restricción no deseado, se pueden mutar in silico eliminando un nucleótido del sitio de restricción de tipo IIS. [5] En este proceso, es necesario asegurarse de que la mutación introducida no afecte la función genética codificada por la secuencia de interés. [5] Se prefiere una mutación silenciosa en la secuencia codificante, ya que no cambia la secuencia de la proteína ni la función del gen de interés. [5]
Los fragmentos de nivel -1 se utilizan para ayudar a clonar módulos grandes de nivel 0. [5] Para clonar fragmentos de nivel -1, se puede utilizar la clonación de extremos romos con ligadura de restricción. [5] El vector utilizado en la clonación de fragmentos de nivel -1 no puede contener el sitio de restricción de tipo IIS BpiI que se utiliza para el siguiente paso de ensamblaje. [5] Además, el vector también debe tener un marcador de selección diferente del vector de destino en el siguiente paso de ensamblaje, por ejemplo, si se utiliza resistencia a la espectinomicina en módulos de nivel 0, los fragmentos de nivel -1 deben tener otra resistencia a antibióticos como la ampicilina. [5]
El vector de destino de nivel 1 determina la posición y orientación de cada gen en la construcción final. [10] Hay catorce vectores de nivel 1 disponibles, que difieren solo en la secuencia de los sitios de fusión flanqueantes mientras que son idénticos en los sitios de fusión internos. [10] Por lo tanto, todos los vectores pueden ensamblar las mismas partes de nivel 0. [10]
Como todos los vectores de nivel 1 son plásmidos binarios, se utilizan para la expresión temporal mediada por Agrobacterium en plantas. [10]
Los vectores de nivel 2 tienen dos sitios BpiI invertidos a partir de la inserción de módulos de nivel 1. [10] El sitio de fusión ascendente es compatible con un gen clonado en el vector de nivel 1, mientras que el sitio de fusión descendente tiene una secuencia universal. [10] Cada clonación permite insertar de 2 a 6 genes en el mismo vector. [10]
No se recomienda agregar más genes en un paso de clonación, ya que esto daría como resultado construcciones incorrectas. [10] Por un lado, esto puede inducir más sitios de restricción en la construcción, donde esta construcción abierta permite que se agreguen genes adicionales. [10] Por otro lado, esto también puede eliminar sitios de restricción, donde esta construcción cerrada detiene la adición adicional de genes. [10]
Por lo tanto, los constructos de más de seis genes necesitan pasos de clonación sucesivos, lo que requiere enlaces terminales que contengan sitios de restricción internos BsaI o BsmBI y marcadores azules o morados. [10] Cada paso de clonación necesita alternar el sitio de restricción y el marcador. [10] Además, se necesitan dos enzimas de restricción, donde BpiI se utiliza para liberar módulos de nivel 1 de los constructos de nivel 1 y BsaI/BsmBI es para digerir y abrir el plásmido receptor de nivel 2-n. [10] Al realizar la selección, las colonias correctas deben alternar de azul a morado en cada paso de clonación, pero si se utiliza un enlace terminal "cerrado", las colonias serán blancas. [10]
Los vectores de nivel M son similares a los de nivel 2, pero tienen un sitio BsaI ubicado aguas arriba de los dos sitios BpiI invertidos. [11] Cuando uno o varios genes se clonan en un vector de nivel M, se agrega un segundo BsaI al final de la construcción a través de un enlazador final de nivel M (ref). Esto permite que un fragmento que contiene todos los genes ensamblados se escinda del vector y se subclone en un siguiente nivel de clonación (nivel P).
Los vectores de nivel P son similares a los constructos de nivel M, excepto que los sitios BpiI se reemplazan por sitios BsaI y los sitios BsaI se reemplazan por sitios BpiI. Se pueden subclonar varios constructos de nivel M con sitios de fusión compatibles en un vector de nivel P en un solo paso. Teóricamente, se pueden ensamblar hasta 36 genes en un constructo utilizando 6 reacciones de nivel M paralelas (cada una requerida para el ensamblaje de 6 genes por constructo de nivel M) seguidas de una reacción final de nivel P. En la práctica, generalmente se ensamblan menos genes ya que la mayoría de los proyectos de clonación no requieren tantos genes. La estructura de los vectores de nivel M y P está diseñada de tal manera que los genes clonados en constructos de nivel P se pueden ensamblar aún más en vectores de nivel M. La clonación repetida en vectores de nivel M y P forma un bucle que se puede repetir indefinidamente para ensamblar constructos progresivamente más grandes.
En la clonación Golden Gate estándar, los sitios de restricción del constructo de nivel anterior no se pueden reutilizar. [12] Para agregar más genes al constructo, se deben agregar sitios de restricción de una enzima de restricción de tipo IIS diferente al vector de destino. [12] Esto se puede hacer utilizando el nivel 2 o M y P. GoldenBraid también proporciona una versión variante del nivel M y P.
GoldenBraid supera el problema de diseñar numerosos vectores de destino al tener un bucle doble, que es la "trenza", para permitir el ensamblaje binario de múltiples construcciones. [12] Hay dos niveles de plásmidos de destino, nivel α y nivel Ω. [12] Cada nivel de plásmidos se puede utilizar como plásmidos de entrada para el otro nivel de plásmidos varias veces porque ambos niveles de plásmidos tienen diferentes sitios de restricción de tipo IIS que están en orientación invertida. [12] Para la contraselección, los dos niveles de plásmidos difieren en sus marcadores de resistencia a los antibióticos. [12]
El principio de clonación Golden Gate también se puede aplicar para realizar mutagénesis, denominada mutagénesis dorada. La tecnología es fácil de implementar, ya que existe una herramienta web disponible para el diseño de cebadores (https://msbi.ipb-halle.de/GoldenMutagenesisWeb/) y los vectores se encuentran depositados en addgene (http://www.addgene.org/browse/article/28196591/). [13]
El nombre Golden Gate Assembly proviene de una propuesta de Yuri Gleba. [1] Por un lado, hace referencia a la tecnología de puerta de enlace y, por otro, representa la mayor precisión con un puente que conecta las calles de dos orillas sin problemas. Uno de los puentes más conocidos es el Golden Gate Bridge en San Francisco .
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