Electroforesis en gel de agarosa
Las proteínas pueden separarse por carga y/o tamaño (la electroforesis de agarosa con enfoque isoeléctrico es esencialmente independiente del tamaño), y los fragmentos de ADN y ARN por longitud.
[3] La estructura tridimensional se mantiene unida mediante enlaces de hidrógeno y, por lo tanto, puede romperse calentándola hasta que vuelva a su estado líquido.
[7] También puede utilizarse para separar proteínas de gran tamaño, y es la matriz preferida para la electroforesis en gel de partículas con radios efectivos superiores a 5-10 nm.
Un gel de agarosa al 0,9% tiene poros suficientemente grandes para la entrada del bacteriófago T4.
[6] El polímero de agarosa contiene grupos cargados, en particular piruvato y sulfato.
[8] Estos grupos cargados negativamente crean un flujo de agua en dirección opuesta al movimiento del ADN en un proceso denominado electroendosmosis (EEO), por lo que pueden retardar el movimiento del ADN y provocar la difuminación de las bandas.
Sin embargo, las agarosas sin EEO son indeseables para algunas aplicaciones, ya que pueden fabricarse añadiendo grupos cargados positivamente y dichos grupos pueden afectar a las reacciones enzimáticas posteriores.
[11] Las moléculas más pequeñas se desplazan más rápidamente que las grandes en el gel, y el ADN bicatenario se desplaza a una velocidad inversamente proporcional al logaritmo del número de pares de bases.
La movilidad del ADN también puede cambiar en un campo inestable: en un campo que se invierte periódicamente, la movilidad del ADN de un tamaño determinado puede disminuir significativamente a una frecuencia de ciclo concreta.
Uno ampliamente aceptado es el modelo de Ogston, que trata la matriz polimérica como un tamiz.
La agarosa fundida se deja enfriar lo suficiente antes de verter la solución en un molde, ya que éste puede deformarse o agrietarse si la solución de agarosa está demasiado caliente.
Una vez fraguado el gel, se retira el peine, dejando pocillos en los que pueden cargarse las muestras de ADN.
También es posible, aunque menos común, realizar la electroforesis verticalmente, así como horizontalmente con el gel elevado sobre patas de agarosa utilizando un aparato apropiado.
[28] Dado que el ADN no es visible a la luz natural, el progreso de la electroforesis se controla mediante colorantes.
El ADN y el ARN se visualizan normalmente mediante tinción con bromuro de etidio, que se intercala en los surcos principales del ADN y es fluorescente bajo la luz ultravioleta.
[29]SYBR Green, GelRed y otros productos comerciales similares se venden como alternativas más seguras al bromuro de etidio, ya que se ha demostrado que es mutagénico en la prueba de Ames, aunque en realidad no se ha establecido la carcinogenicidad del bromuro de etidio.
El ADN teñido con violeta cristal puede observarse con luz natural sin necesidad de utilizar un transiluminador de luz ultravioleta, lo cual es una ventaja, aunque puede que no produzca una banda intensa.
[12] Los transiluminadores estándar utilizan longitudes de onda de 302/312 nm (UV-B), pero la exposición del ADN a la radiación ultravioleta durante tan sólo 45 segundos puede dañar el ADN y afectar a los procedimientos posteriores, por ejemplo, reduciendo la eficacia de la transformación, la transcripción in vitro y la PCR.
Sin embargo, los contaminantes pueden afectar a algunos procedimientos posteriores, como la PCR, y en algunos casos se prefiere la agarosa de bajo punto de fusión, ya que contiene menos sulfatos que pueden afectar a algunas reacciones enzimáticas.
En general, el tampón ideal debe tener una buena conductividad, producir menos calor y tener una larga vida útil.
[33] Los geles de agarosa se moldean y manipulan fácilmente en comparación con otras matrices y los ácidos nucleicos no se alteran químicamente durante la electroforesis.
Una vez finalizado el experimento, el gel resultante puede guardarse en una bolsa de plástico en el frigorífico.
La electroforesis se realiza en soluciones tampón para reducir los cambios de pH debidos al campo eléctrico, lo cual es importante porque la carga del ADN y el ARN depende del pH, pero si se realiza durante demasiado tiempo puede agotarse la capacidad tampón de la solución.
