Existen muchos métodos para investigar las interacciones proteína-proteína , que son los contactos físicos de alta especificidad establecidos entre dos o más moléculas de proteínas que involucran fuerzas electrostáticas y efectos hidrofóbicos . Cada uno de los enfoques tiene sus propias fortalezas y debilidades, especialmente en lo que respecta a la sensibilidad y especificidad del método. [1] Una alta sensibilidad significa que muchas de las interacciones que ocurren son detectadas por la pantalla. Una alta especificidad indica que la mayoría de las interacciones detectadas por la pantalla están ocurriendo en la realidad.
Se considera que la coinmunoprecipitación [ cita necesaria ] es el ensayo estándar de oro para las interacciones proteína-proteína, especialmente cuando se realiza con proteínas endógenas (no sobreexpresadas ni marcadas ). La proteína de interés se aísla con un anticuerpo específico . Las parejas de interacción que se adhieren a esta proteína se identifican posteriormente mediante transferencia Western . [2] Las interacciones detectadas mediante este enfoque se consideran reales. Sin embargo, este método sólo puede verificar las interacciones entre socios sospechosos de interacción. Por tanto, no es un método de detección. Una nota de precaución también es que los experimentos de inmunoprecipitación revelan interacciones directas e indirectas. Por tanto, los resultados positivos pueden indicar que dos proteínas interactúan directamente o pueden interactuar a través de una o más moléculas puente. Esto podría incluir proteínas puente, ácidos nucleicos (ADN o ARN) u otras moléculas.
La complementación de fluorescencia bimolecular (BiFC) es una nueva técnica para observar las interacciones de proteínas. Combinado con otras técnicas nuevas, este método se puede utilizar para detectar interacciones proteína-proteína y sus moduladores, [3] DERB. [4]
Electroforesis de afinidad como se utiliza para la estimación de constantes de unión , como por ejemplo en electroforesis de afinidad de lectinas o caracterización de moléculas con características específicas como contenido de glucano o unión de ligando .
Los ensayos desplegables son una variación común de la inmunoprecipitación y la inmunoelectroforesis y se usan de manera idéntica, aunque este enfoque es más adecuado para una detección inicial de proteínas que interactúan.
La transferencia de etiquetas se puede utilizar para detectar o confirmar interacciones entre proteínas y puede proporcionar información sobre la interfaz donde tiene lugar la interacción. La transferencia de etiquetas también puede detectar interacciones débiles o transitorias que son difíciles de capturar utilizando otras estrategias de detección in vitro . En una reacción de transferencia de etiquetas, una proteína conocida se marca con una etiqueta detectable. Luego, la etiqueta se pasa a una proteína que interactúa, que luego puede identificarse por la presencia de la etiqueta.
La presentación en fagos se utiliza para la detección de alto rendimiento de interacciones entre proteínas.
La reticulación in vivo de complejos proteicos utilizando análogos de aminoácidos fotorreactivos fue introducida en 2005 por investigadores del Instituto Max Planck [5]. En este método, las células se cultivan con análogos fotorreactivos de diazirina a leucina y metionina , que se incorporan a las proteínas. Tras la exposición a la luz ultravioleta, las diazirinas se activan y se unen a proteínas que interactúan y que se encuentran a unos pocos angstroms del análogo de aminoácido fotorreactivo. [6]
El método de purificación por afinidad en tándem (TAP) permite una identificación de alto rendimiento de interacciones de proteínas. A diferencia del enfoque de dos híbridos de levadura, la precisión del método se puede comparar con la de experimentos a pequeña escala [7] y las interacciones se detectan dentro del entorno celular correcto mediante coinmunoprecipitación . Sin embargo, el método de la etiqueta TAP requiere dos pasos sucesivos de purificación de proteínas y, en consecuencia, no puede detectar fácilmente interacciones transitorias entre proteínas. Krogan et al. realizaron experimentos TAP recientes en todo el genoma . y Gavin et al. proporcionando datos actualizados de interacción de proteínas para organismos de levadura. [8] [9]
El entrecruzamiento químico se utiliza a menudo para "fijar" las interacciones de proteínas en su lugar antes de intentar aislar/identificar las proteínas que interactúan. Los entrecruzadores comunes para esta aplicación incluyen el reticulante de éster NHS no escindible , suberato de bissulfosuccinimidilo (BS3); una versión escindible de BS3, ditiobis(propionato de sulfosuccinimidilo) (DTSSP); y el reticulador de imidoéster dimetilditiobispropionimidato (DTBP), que es popular para fijar interacciones en ensayos ChIP .
La reticulación química seguida de espectrometría de masas MALDI de alta masa se puede utilizar para analizar las interacciones de proteínas intactas antes de intentar aislar/identificar las proteínas que interactúan. Este método detecta interacciones entre proteínas no etiquetadas y está disponible en CovalX .
SPINE (experimento de interacción de estrepproteínas) [10] utiliza una combinación de entrecruzamiento reversible con formaldehído y una incorporación de una etiqueta de afinidad para detectar parejas de interacción in vivo .
La inmunoprecipitación cuantitativa combinada con eliminación (QUICK) se basa en la coinmunoprecipitación, la espectrometría de masas cuantitativa ( SILAC ) y la interferencia de ARN (RNAi). Este método detecta interacciones entre proteínas endógenas no etiquetadas. [11] Por lo tanto, tiene el mismo alto nivel de confianza que la coinmunoprecipitación. Sin embargo, este método también depende de la disponibilidad de anticuerpos adecuados.
El ensayo de ligadura de proximidad (PLA) in situ es un método inmunohistoquímico que utiliza las denominadas sondas PLA para la detección de proteínas, interacciones y modificaciones de proteínas. Cada sonda PLA viene con una cadena corta de ADN única unida a ella y se une a anticuerpos primarios específicos de especies o consiste en anticuerpos primarios directamente marcados con ADN. [12] [13] Cuando las sondas de PLA están muy cerca, las cadenas de ADN pueden interactuar mediante una adición posterior de otros dos oligonucleótidos de ADN que forman círculos. Después de unir los dos oligonucleótidos añadidos mediante ligación enzimática, se amplifican mediante amplificación por círculo rodante utilizando una polimerasa. Después de la reacción de amplificación, se produjo una replicación de varios cientos de veces del círculo de ADN y las sondas de oligonucleótidos complementarios marcadas con fluoróforos o enzimas resaltan el producto. La alta concentración resultante de fluorescencia o señal cromogénica en cada producto de amplificación de una sola molécula es fácilmente visible como un punto brillante distintivo cuando se observa con un microscopio de fluorescencia o con un microscopio de campo claro estándar.
La resonancia de plasmón superficial (SPR) es la técnica sin etiquetas más común para la medición de interacciones biomoleculares. [ cita necesaria ] Los instrumentos SPR miden el cambio en el índice de refracción de la luz reflejada por una superficie metálica (el "biosensor"). La unión de biomoléculas al otro lado de esta superficie provoca un cambio en el índice de refracción que es proporcional a la masa añadida a la superficie del sensor. En una aplicación típica, un socio de unión (el "ligando", a menudo una proteína) se inmoviliza en el biosensor y una solución con socios de unión potenciales (el "analito") se canaliza sobre esta superficie. La acumulación de analito a lo largo del tiempo permite cuantificar tasas de activación (kon), tasas de desactivación (koff), constantes de disociación (Kd) y, en algunas aplicaciones, concentraciones activas del analito. [14] Varios proveedores diferentes ofrecen dispositivos basados en SPR. Los más conocidos son los instrumentos Biacore , que fueron los primeros disponibles comercialmente.
La interferometría de polarización dual (DPI) se puede utilizar para medir las interacciones proteína-proteína. DPI proporciona mediciones de alta resolución y en tiempo real del tamaño, la densidad y la masa molecular. Si bien el etiquetado no es necesario, una de las especies de proteínas debe inmovilizarse en la superficie de una guía de ondas. Además de la cinética y la afinidad, también se pueden cuantificar los cambios conformacionales durante la interacción.
La dispersión de luz estática (SLS) mide los cambios en la dispersión de Rayleigh de complejos de proteínas en solución y puede caracterizar interacciones tanto débiles como fuertes sin marcaje ni inmovilización de las proteínas u otras biomacromoléculas. La medición de la dispersión de luz estática de múltiples ángulos y gradiente de composición (CG-MALS) mezcla una serie de alícuotas de diferentes concentraciones o composiciones, mide el efecto de los cambios en la dispersión de la luz como resultado de la interacción y ajusta la dispersión de la luz correlacionada. cambia con la concentración a una serie de modelos de asociación para encontrar el descriptor que mejor se ajuste. Las interacciones débiles y no específicas generalmente se caracterizan mediante el segundo coeficiente virial . Para la unión específica, este tipo de análisis puede determinar la estequiometría y las constantes de asociación de equilibrio de uno o más complejos asociados, [15] incluidos sistemas desafiantes como aquellos que exhiben homo y heteroasociación simultánea, interacciones multivalentes y cooperatividad.
La dispersión dinámica de la luz (DLS), también conocida como dispersión cuasielástica de la luz (QELS), o espectroscopia de correlación de fotones, procesa las fluctuaciones dependientes del tiempo en la intensidad de la luz dispersa para producir el radio hidrodinámico de las partículas en solución. El radio hidrodinámico es el radio de una esfera sólida con el mismo coeficiente de difusión traslacional que el medido para la partícula de muestra. A medida que las proteínas se asocian, aumenta el radio hidrodinámico promedio de la solución. La aplicación del método de variación continua, también conocido como gráfico de trabajo , con el radio hidrodinámico de la solución como observable, permite la determinación in vitro de Kd , estequiometría compleja, radio hidrodinámico complejo y Δ H ° y Δ S ° de proteína. –interacciones de proteínas. [16] Esta técnica no implica inmovilización ni etiquetado. Se pueden caracterizar interacciones transitorias y débiles. En relación con la dispersión de la luz estática, que se basa en la intensidad absoluta de la luz dispersa, DLS es insensible a la luz de fondo de las paredes de las estructuras de contención. Esta insensibilidad permite mediciones DLS desde volúmenes de 1 μL en placas de 1536 pocillos y reduce los requisitos de muestra al rango de femtomol. Esta técnica también es adecuada para la detección de componentes tampón y/o inhibidores/efectores de moléculas pequeñas.
El análisis de dispersión inducida por flujo (FIDA) es una nueva tecnología basada en capilares y sin inmovilización que se utiliza para la caracterización y cuantificación de la interacción biomolecular y la concentración de proteínas en condiciones nativas. [17] La técnica se basa en medir el cambio en el tamaño aparente (radio hidrodinámico) de un ligando selectivo cuando interactúa con el analito de interés. Un ensayo FIDA funciona en soluciones complejas (por ejemplo, plasma [18] ) y proporciona información sobre la concentración del analito, las constantes de afinidad, el tamaño molecular y la cinética de unión. Un único ensayo normalmente se completa en minutos y solo requiere un consumo de muestra de unos pocos μL. [17]
La polarización/anisotropía de fluorescencia se puede utilizar para medir las interacciones proteína-proteína o proteína-ligando. Normalmente, una de las partes de unión se marca con una sonda de fluorescencia (aunque a veces se puede utilizar la fluorescencia de la proteína intrínseca del triptófano) y la muestra se excita con luz polarizada. El aumento en la polarización de la fluorescencia tras la unión de la proteína marcada a su pareja de unión se puede utilizar para calcular la afinidad de unión.
Con la espectroscopia de correlación de fluorescencia , una proteína se marca con un tinte fluorescente y la otra se deja sin marcar. Luego, las dos proteínas se mezclan y los datos generan la fracción de la proteína marcada que no está unida y unida a la otra proteína, lo que le permite obtener una medida de KD y afinidad de unión. También puede tomar medidas en el tiempo para caracterizar la cinética de unión. FCS también le indica el tamaño de los complejos formados para que pueda medir la estequiometría de unión. Un método más potente es la espectroscopia de correlación cruzada de fluorescencia (FCCS), que emplea técnicas de doble etiquetado y correlación cruzada, lo que da como resultado relaciones señal-ruido muy mejoradas con respecto a la FCS. Además, la excitación de dos y tres fotones prácticamente elimina los efectos del fotoblanqueo y proporciona un registro ultrarrápido de datos FCCS o FCS.
La transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) es una técnica común al observar las interacciones de diferentes proteínas. [19] [20] [21] [22] Aplicado in vivo, FRET se ha utilizado para detectar la ubicación y las interacciones de genes y estructuras celulares, incluidas integrinas y proteínas de membrana. [23] FRET se puede utilizar para obtener información sobre vías metabólicas o de señalización. [24] [25] [26]
La interferometría de biocapa (BLI) es una tecnología sin etiquetas para medir interacciones biomoleculares [27] [28] (proteína: proteína o proteína: molécula pequeña). Es una técnica analítica óptica que analiza el patrón de interferencia de la luz blanca reflejada desde dos superficies: una capa de proteína inmovilizada en la punta del biosensor y una capa de referencia interna. Cualquier cambio en el número de moléculas unidas a la punta del biosensor provoca un cambio en el patrón de interferencia que se puede medir en tiempo real, proporcionando información detallada sobre la cinética de asociación y disociación de las dos moléculas, así como la constante de afinidad por la interacción de proteínas (ka , kd y Kd ) . Debido a la configuración del sensor, la técnica es muy adaptable tanto a muestras purificadas como crudas, así como a experimentos de detección de alto rendimiento. El método de detección también se puede utilizar para determinar la concentración molar de analitos.
Determinación de la actividad de las proteínas mediante mediciones de relajación multinuclear por RMN o espectroscopia de RMN 2D-FT en soluciones, combinadas con análisis de regresión no lineal de relajación de RMN o conjuntos de datos de espectroscopia de RMN 2D-FT. Mientras que el concepto de actividad del agua es ampliamente conocido y utilizado en las biociencias aplicadas, su complemento (la actividad proteica que cuantifica las interacciones proteína-proteína) es mucho menos familiar para los biocientíficos ya que es más difícil de determinar en soluciones diluidas de proteínas; La actividad de las proteínas también es mucho más difícil de determinar para soluciones proteicas concentradas cuando la agregación de proteínas, y no simplemente la asociación transitoria de proteínas, es a menudo el proceso dominante. [29]
La calorimetría de titulación isotérmica (ITC) se considera la técnica más cuantitativa disponible para medir las propiedades termodinámicas de las interacciones proteína-proteína y se está convirtiendo en una herramienta necesaria para los estudios estructurales de complejos proteína-proteína. Esta técnica se basa en la medición precisa de los cambios de calor que siguen a la interacción de moléculas de proteínas en solución, sin la necesidad de marcar o inmovilizar a las partes de unión, ya que la absorción o producción de calor es una propiedad intrínseca de prácticamente todas las reacciones bioquímicas. ITC proporciona información sobre la estequiometría, entalpía, entropía y cinética de unión entre dos proteínas que interactúan. [30]
La termoforesis a microescala (MST) es un nuevo método que permite el análisis cuantitativo de interacciones moleculares en solución a escala de microlitros. La técnica se basa en la termoforesis de moléculas, que proporciona información sobre el tamaño de la molécula, su carga y su capa de hidratación. Dado que al menos uno de estos parámetros normalmente se ve afectado por la unión, el método puede usarse para el análisis de cada tipo de interacción o modificación biomolecular. El método funciona igualmente bien en tampones estándar y líquidos biológicos como sangre o lisado celular. Es un método de solución gratuito que no necesita inmovilizar a los socios vinculantes. MST proporciona información sobre la afinidad de unión, estequiometría, competencia y entalpía de dos o más proteínas que interactúan. [31] [32]
El ensayo de unión de ligandos basados en células rotativas que utiliza radiactividad o fluorescencia es un método reciente que mide las interacciones moleculares en células vivas en tiempo real. Este método permite la caracterización del mecanismo de unión, así como K d , k on y k off . Este principio se está aplicando en varios estudios, principalmente con ligandos de proteínas y células vivas de mamíferos. [33] [34] [35] [36] Una tecnología alternativa para medir las interacciones de proteínas directamente en las células es la citometría de interacción en tiempo real (RT-IC). [37] En esta tecnología, las células vivas o fijas se retienen físicamente en la superficie de chips biosensores utilizando trampas de polímeros biocompatibles y permeables al flujo. [38] La unión y desunión de analitos marcados inyectados automáticamente se mide mediante detección de fluorescencia resuelta en el tiempo.
La reflectometría de un solo color (SCORE) es una tecnología sin etiquetas para medir todo tipo de interacciones biomoleculares en tiempo real. Al igual que BLI, aprovecha los efectos de interferencia en capas delgadas. Sin embargo, no necesita una resolución espectral sino que utiliza luz monocromática. Por lo tanto, es posible analizar no sólo una única interacción sino también conjuntos de alta densidad con hasta 10.000 interacciones por cm 2 . [39]
switchSENSE es una tecnología basada en nanopalancas de ADN en la superficie de un chip. A esta nanopalanca se unen un tinte fluorescente y el ligando sin marcar. Tras la unión de un analito al ligando, las tasas cinéticas en tiempo real (kon , koff ) se pueden medir como cambios en la intensidad de la fluorescencia y se puede derivar la Kd . Este método se puede utilizar para investigar las interacciones proteína-proteína, así como para investigar los moduladores de las interacciones proteína-proteína mediante la evaluación de la formación de complejos ternarios. Un ejemplo de este tipo de moduladores son los PROTAC , cuyo potencial terapéutico se investiga en el tratamiento del cáncer. Otro ejemplo de este tipo de interacciones ternarias son los anticuerpos biespecíficos que se unen a sus dos antígenos distintos. [40] switchSENSE también se puede utilizar para detectar cambios conformacionales inducidos por ligandos que se unen a una proteína objetivo. [41]
La selección de dos híbridos de levadura y dos híbridos bacterianos [42] investiga la interacción entre proteínas de fusión artificiales. No requieren el aislamiento de proteínas, sino que utilizan la transformación para expresar proteínas en bacterias o levaduras . Las células están diseñadas de manera que una interacción activa la transcripción de un gen informador o una enzima informadora . [43]
La mayoría de los métodos PPI requieren algún análisis de datos computacionales. Los métodos de esta sección son principalmente computacionales, aunque normalmente requieren datos generados por experimentos de laboratorio húmedo.
El acoplamiento proteína-proteína , la predicción de las interacciones proteína-proteína basada únicamente en las estructuras tridimensionales de las proteínas a partir de la difracción de rayos X de los cristales de proteínas podría no ser satisfactoria. [44] [45]
El análisis de redes incluye el análisis de redes de interacción utilizando métodos de teoría de grafos o métodos estadísticos. El objetivo de estos estudios es comprender la naturaleza de las interacciones en el contexto de una célula o vía , no solo las interacciones individuales. [46]
{{cite web}}: Mantenimiento CS1: copia archivada como título ( enlace )