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Ensayo de ligadura de proximidad

Figura 1 : PLA comienza con la unión de anticuerpos de diferentes especies a 2 proteínas de interés, en este caso proteína * (estrella) y proteína #

El ensayo de ligadura de proximidad ( PLA in situ ) es una tecnología que amplía las capacidades de los inmunoensayos tradicionales para incluir la detección directa de proteínas , interacciones de proteínas, vesículas extracelulares y modificaciones postraduccionales con alta especificidad y sensibilidad. [1] [2] Las proteínas objetivo se pueden detectar y localizar fácilmente con resolución de una sola molécula y cuantificarse objetivamente en células y tejidos no modificados. Utilizando sólo unas pocas células, los eventos subcelulares, incluso las interacciones transitorias o débiles, se revelan in situ y se pueden diferenciar subpoblaciones de células. En cuestión de horas, se pueden confirmar los resultados de las técnicas convencionales de coinmunoprecipitación y colocalización. [3]

El principio PLA

Figura 2 : Unión de sondas PLA.

Dos anticuerpos primarios generados en diferentes especies reconocen el antígeno diana en las proteínas de interés (Figura 1). Los anticuerpos secundarios (2 o Ab) dirigidos contra las regiones constantes de los diferentes anticuerpos primarios, denominados sondas PLA, se unen a los anticuerpos primarios (Figura 2).

Figura 3 : Comienza la síntesis de ADN en círculo rodante.

Cada una de las sondas de PLA tiene una cadena de ADN específica de secuencia corta unida. Si las sondas de PLA están próximas (es decir, si las dos proteínas originales de interés están próximas o son parte de un complejo proteico, como se muestra en las figuras), las hebras de ADN pueden participar en la síntesis de ADN en círculo rodante tras la adición de dos. otros oligonucleótidos de ADN de secuencia específica junto con sustratos y enzimas apropiados (Figura 3).

Figura 4 : Las sondas fluorescentes se unen al ADN amplificado.

La reacción de síntesis de ADN da como resultado una amplificación de varios cientos de veces del círculo de ADN. A continuación, se añaden sondas de oligonucleótidos complementarios marcadas con fluorescencia y se unen al ADN amplificado (Figura 4). La alta concentración de fluorescencia resultante es fácilmente visible como un punto brillante distintivo cuando se observa con un microscopio de fluorescencia . [4] En el caso específico que se muestra (Figura 5), ​​el núcleo está agrandado porque se trata de una célula de linfoma de células B. Las dos proteínas de interés son un receptor de células B y MYD88 . El hallazgo de interacción en el citoplasma fue interesante porque se cree que los receptores de células B están ubicados en la membrana celular. [5]

Figura 5 : Imagen de microscopía de fluorescencia que muestra la interacción de las proteínas en el citoplasma. Núcleo en azul, producto PLA en rojo.

Aplicaciones

El PLA, como se describe anteriormente, se ha utilizado para estudiar aspectos del desarrollo animal [6] [7] y el cáncer de mama [8], entre muchos otros temas. Los ensayos de ligadura de proximidad in situ (isPLA) se han aplicado a la validación de anticuerpos en tejidos humanos con varias ventajas sobre la IHC, incluida una mayor especificidad de detección, una menor tinción inespecífica y una mejor localización. [9] Se ha utilizado una variación de la técnica (rISH-PLA) para estudiar la asociación de proteínas y ARN . [10] Otra variación del PLA in situ incluye un ensayo de PLA múltiple que permite visualizar múltiples complejos de proteínas en paralelo. [11] PLA también se puede combinar con otras formas de lectura como ELISA , [12] citometría de flujo . [13] [14] y transferencia Western [15]

Referencias

  1. ^ Löf L, Arngården L, Ebai T, Landegren U, Söderberg O, Kamali-Moghaddam M (2017). "Detección de vesículas extracelulares mediante ensayo de ligadura de proximidad con lectura de citometría de flujo: ExoPLA" . Protocolos actuales en citometría . 81 (1): 4.8.1–4.8.10. doi :10.1002/cpcy.22. ISSN  1934-9300. PMID  28678418. S2CID  4379414.
  2. ^ Gullberg M, Gústafsdóttir SM, Schallmeiner E, Jarvius J, Bjarnegård M, Betsholtz C, Landegren U, Fredriksson S (junio de 2004). "Detección de citocinas mediante ligadura de proximidad basada en anticuerpos". Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América . 101 (22): 8420–4. Código Bib : 2004PNAS..101.8420G. doi : 10.1073/pnas.0400552101 . PMC 420409 . PMID  15155907. 
  3. ^ Söderberg O, Gullberg M, Jarvius M, Ridderstråle K, Leuchowius KJ, Jarvius J, Wester K, Hydbring P, Bahram F, Larsson LG, Landegren U (diciembre de 2006). "Observación directa de complejos proteicos endógenos individuales in situ mediante ligadura de proximidad". Métodos de la naturaleza . 3 (12): 995–1000. doi : 10.1038/nmeth947. PMID  17072308. S2CID  21819907.
  4. ^ Gustafsdottir SM, Schallmeiner E, Fredriksson S, Gullberg M, Söderberg O, Jarvius M, Jarvius J, Howell M, Landegren U (octubre de 2005). "Ensayos de ligadura de proximidad para análisis de proteínas sensibles y específicas". Bioquímica Analítica . 345 (1): 2–9. doi :10.1016/j.ab.2005.01.018. PMID  15950911.
  5. ^ Staudt L (febrero de 2017). "Terapia del linfoma inspirada en la genómica funcional y estructural". videocast.nih.gov . Institutos Nacionales de Salud . Consultado el 3 de febrero de 2017 .
  6. ^ Wang S, Yoo S, Kim HY, Wang M, Zheng C, Parkhouse W, Krieger C, Harden N (enero de 2015). "Detección de complejos proteína-proteína in situ en la unión neuromuscular larvaria de Drosophila mediante ensayo de ligadura de proximidad". Revista de experimentos visualizados (95): 52139. doi :10.3791/52139. PMC 4354543 . PMID  25650626. 
  7. ^ Kwon J, Jeong SM, Choi I, Kim NH (2016). "ADAM10 participa en el ensamblaje de uniones celulares en el desarrollo temprano de embriones porcinos". MÁS UNO . 11 (4): e0152921. Código Bib : 2016PLoSO..1152921K. doi : 10.1371/journal.pone.0152921 . PMC 4820119 . PMID  27043020. 
  8. ^ Chetan C. Oturkar, Spencer R. Rosario, Gokul M. Das (2024). La alteración del interactoma ESR1 y p53 define los mecanismos de respuesta del tamoxifeno en el cáncer de mama luminal. iCiencia . | vautores = Vincent A, Berthel E, Dacheux E, Magnard C, Venezia NL | title = BRCA1 afecta la señalización de la proteína fosfatasa 6 a través de su interacción con ANKRD28 | revista = La revista bioquímica | volumen = 473 | problema = 7 | páginas = 949–60 | fecha = Abril 2016 | pmid = 27026398 | doi = 10.1042/BJ20150797 }}
  9. ^ Lindskog C, Backman M, Zieba A, Asplund A, Uhlén M, Landegren U, Pontén F (julio de 2020). "Ensayo de ligadura de proximidad como herramienta para la validación de anticuerpos en tejidos humanos". Revista de histoquímica y citoquímica . 68 (7): 515–529. doi : 10.1369/0022155420936384. ISSN  0022-1554. PMC 7350078 . PMID  32602410. 
  10. ^ Roussis IM, Guille M, Myers FA, Scarlett GP (2016). "Ensayo de ligadura de proximidad de hibridación in situ de montaje completo de ARN (rISH-PLA), un ensayo para detectar complejos de ARN-proteína en células intactas". MÁS UNO . 11 (1): e0147967. Código Bib : 2016PLoSO..1147967R. doi : 10.1371/journal.pone.0147967 . PMC 4732756 . PMID  26824753. 
  11. ^ Leuchowius KJ, Clausson CM, Grannas K, Erbilgin Y, Botling J, Zieba A, et al. (Junio ​​del 2013). "Visualización paralela de múltiples complejos proteicos en células individuales en tejido tumoral". Proteómica molecular y celular . 12 (6): 1563–71. doi : 10.1074/mcp.O112.023374 . PMC 3675814 . PMID  23436906. 
  12. ^ Ebai T, Souza de Oliveira FM, Löf L, Wik L, Schweiger C, Larsson A, et al. (septiembre de 2017). "Detección de proteínas analíticamente sensibles en placas de microtitulación mediante ligadura de proximidad con amplificación de círculo rodante". Química Clínica . 63 (9): 1497-1505. doi : 10.1373/clinchem.2017.271833 . PMID  28667186.
  13. ^ Leuchowius KJ, Weibrecht I, Landegren U, Gedda L, Söderberg O (octubre de 2009). "Análisis de ligadura de proximidad in situ por citometría de flujo de interacciones de proteínas y modificación postraduccional de la familia de receptores del factor de crecimiento epidérmico". Citometría. Parte A. 75 (10): 833–9. doi : 10.1002/cyto.a.20771 . PMID  19650109. S2CID  2550136.
  14. ^ Löf L, Arngården L, Olsson-Strömberg U, Siart B, Jansson M, Dahlin JS, et al. (Abril de 2017). "Medición de citometría de flujo de células sanguíneas con proteína de fusión BCR-ABL1 en leucemia mieloide crónica". Informes científicos . 7 (1): 623. Código bibliográfico : 2017NatSR...7..623L. doi :10.1038/s41598-017-00755-y. PMC 5429594 . PMID  28377570. 
  15. ^ Liu Y, Gu J, Hagner-McWhirter Å, Sathiyanarayanan P, Gullberg M, Söderberg O, et al. (noviembre de 2011). "Western blot mediante ligadura de proximidad para análisis de proteínas de alto rendimiento". Proteómica molecular y celular . 10 (11): O111.011031. doi : 10.1074/mcp.O111.011031 . PMC 3226413 . PMID  21813417.