La interferometría de biocapa ( BLI ) es una tecnología de biodetección óptica que analiza interacciones biomoleculares en tiempo real sin necesidad de etiquetado fluorescente. [1] Junto con la resonancia de plasmones superficiales , BLI es una de las pocas tecnologías de biodetección sin etiquetas ampliamente disponibles , un estilo de detección que produce más información en menos tiempo que los procesos tradicionales. [2] La tecnología se basa en la correlación de longitud de onda de cambio de fase creada entre patrones de interferencia de dos superficies únicas en la punta de un biosensor. [3] BLI tiene aplicaciones importantes en la cuantificación de la fuerza de unión, la medición de las interacciones de proteínas y la identificación de propiedades de la cinética de reacción, como las constantes de velocidad y las velocidades de reacción. [4]
"La interferometría de biocapa mide la cinética y las interacciones biomoleculares sobre la base de la interferencia de ondas ". Para prepararse para el análisis BLI entre dos biomoléculas únicas, primero se inmoviliza el ligando en un biosensor biocompatible mientras el analito está en solución. [5] Poco después de esto, la punta del biosensor se sumerge en la solución y la molécula objetivo comenzará a asociarse con el analito, produciendo una capa encima de la punta del biosensor. Esto crea dos superficies separadas: el sustrato en sí y el sustrato que interactúa con la molécula inmovilizada en la punta del biosensor. [1] Esto esencialmente crea una interferencia de película delgada , en la que la capa creada actúa como una película delgada unida por estas dos superficies. La luz blanca de una lámpara de tungsteno se proyecta sobre la punta del biosensor y se refleja en ambas superficies, creando dos patrones de reflexión únicos con diferentes intensidades . [5] La Figura 2 expresa este fenómeno de una forma más general. El cambio de longitud de onda (Δλ) entre estos dos patrones de reflexión crea un patrón de interferencia (Figura 3) a partir del cual se pueden obtener todos los resultados deseados. [1] Dado que el cambio de longitud de onda es una medida directa del cambio en el espesor de la capa biológica y el espesor de la capa biológica cambiará en respuesta a las moléculas que se asocian y se disocian del biosensor, el patrón de interferencia permitirá el monitoreo en tiempo real de las moléculas. Interacciones en la superficie del biosensor. [6] En resumen, un cambio de longitud de onda positivo implica un aumento en el espesor de la biocapa y, por lo tanto, más asociación, mientras que un cambio de longitud de onda negativo implica una disminución en el espesor de la biocapa y, por lo tanto, más disociación. [6]
Las plataformas de interferometría de biocapa logran un alto rendimiento mediante la utilización de un formato "Dip and Read". [1] Las puntas del biosensor se transportan directamente a la muestra deseada y se "sumergen" en su compartimento respectivo, eliminando la necesidad de microfluidos y las complicaciones (obstrucción, purificación) que conlleva. [1] [7] Esta estructura suele estar respaldada por un robot, y para lograrlo se combinan formatos de placas de 96 y 384 pocillos. [8] Este método de detección distinto garantiza que la concentración y la viscosidad de la muestra y los índices de refracción variables rara vez afecten los resultados de BLI. [1] Por lo tanto, BLI encuentra un uso significativo en medios viscosos como el glicerol, donde otras técnicas pueden tener dificultades. [9]
La interferometría de biocapa se basa en biosensores con una punta de fibra óptica sobre la cual se inmoviliza el ligando. [1] La punta está recubierta adicionalmente con una matriz biocompatible con la molécula objetivo para limitar cualquier unión no específica. Para que los cálculos de BLI funcionen, es necesario asumir que tanto la punta de la fibra óptica como el ligando y el analito unidos actúan como superficies delgadas y reflectantes. [10] Los biosensores son desechables, lo que resulta en bajos costos y alta disponibilidad comercial. [11] La selección del biosensor está determinada por los resultados de la prueba deseados: análisis cinético, análisis cuantitativo o ambos. [12] La mayoría de los tipos de biosensores disponibles comercialmente serán agrupados en una de estas tres categorías por el fabricante de BLI. [1]
Un uso clave de la interferometría de biocapa es analizar y cuantificar interacciones entre conjuntos de biomoléculas. [1] Esto es extremadamente útil en la investigación farmacéutica, en la que la interacción biomolécula-membrana determina las características de un fármaco determinado. Debido a su capacidad para lograr datos de alta resolución y alto rendimiento, BLI se ha utilizado para identificar propiedades biofísicas de bicapas lipídicas, lo que permite un método de estudio alternativo a los métodos in vitro tradicionales utilizados actualmente ( microscopía , electroforesis ). [6] Además, BLI se puede utilizar para estudiar las interacciones entre el complejo efector y el objetivo. Cuando se puede utilizar el método tradicional de ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA), BLI puede actuar como un sustituto adecuado si se desean los beneficios proporcionados (mediciones en tiempo real sin etiquetas). [3]
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La interferometría de biocapa se puede utilizar para analizar la cinética en sistemas biomoleculares. Los beneficios que aporta BLI brindan información adicional sobre la cinética además de los métodos de criterio de valoración comúnmente utilizados, como el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). [1] Los patrones de interferencia encontrados en experimentos BLI se pueden utilizar para calcular constantes de velocidad y otros datos cinéticos en interacciones biomoleculares. [13] La sensibilidad (relativamente) más baja del sensor BLI da como resultado una menor respuesta a los cambios en la composición de la muestra. Como resultado, BLI también se puede utilizar para investigar los efectos alostéricos sobre los cambios conformacionales de las enzimas. [14]
BLI y SPR son tecnologías dominantes en el mercado de instrumentos sin etiquetas. [1] A pesar de compartir algunas similitudes en el concepto, existen diferencias significativas entre las dos técnicas. La SPR de microfluidos se basa en una arquitectura cerrada para transportar muestras a un chip sensor estacionario (Figura 4). En cambio, BLI utiliza un sistema abierto que agita varios pocillos en una placa para transportar los sensores a las muestras sin necesidad de microfluidos . [6] Al ser un sistema cerrado, las fases de asociación y disociación de SPR están limitadas por el diseño de la tecnología. El diseño de placa abierta de BLI da como resultado límites de longitud de asociación y disociación determinados por la evaporación de la muestra. [15] SPR es fácilmente reproducible debido a sus microfluidos de flujo continuo. El diseño de placa multipocillo de BLI permite un rendimiento extremadamente alto en un solo lote. La configuración del ensayo en BLI puede, en condiciones estables, permitir la recuperación de muestras. La configuración del ensayo en SPR permite una mayor sensibilidad. Como resultado, los resultados de BLI a menudo se comparan con los resultados de SPR para su validación. [dieciséis]