La microscopía de reflexión por interferencia ( IRM ), también llamada microscopía de contraste por interferencia por reflexión ( RICM ) o microscopía de contraste por reflexión ( RCM ) según los elementos ópticos específicos utilizados, es una técnica de microscopía óptica que aprovecha los efectos de interferencia de película delgada para formar una imagen de un objeto sobre una superficie de vidrio. La intensidad de la señal es una medida de la proximidad del objeto a la superficie del vidrio. Esta técnica se puede utilizar para estudiar eventos en la membrana celular sin el uso de una etiqueta (fluorescente) como es el caso de la microscopía TIRF .
En 1964, Adam SG Curtis acuñó el término Microscopía de Reflexión de Interferencia ( IRM ), utilizándolo en el campo de la biología celular para estudiar fibroblastos de corazón de pollo embrionario. [1] [2] Utilizó IRM para observar los sitios de adhesión y las distancias de los fibroblastos, notando que el contacto con el vidrio se limitaba principalmente a la periferia celular y los pseudópodos . [1]
En 1975, Johan Sebastiaan Ploem introdujo una mejora en el método de microscopía de contraste por reflexión (IRM, Reflection Interference Contrast Microscopy) (publicada en un capítulo de un libro [ 3] ), a la que llamó Microscopía de Contraste por Reflexión ( RCM , Reflection Interference Contrast Microscopy ). [4] La mejora consiste en utilizar un objetivo antiflexible y polarizadores cruzados para reducir aún más la luz dispersa en el sistema óptico. Hoy en día, este esquema se conoce principalmente como Microscopía de Contraste por Interferencia por Reflexión ( RICM, Reflection Interference Contrast Microscopy ), [5] [6] cuyo nombre fue introducido por Bareiter-Hahn y Konrad Beck en 1979. [7]
Sin embargo, el término IRM se utiliza a veces para describir una configuración RICM. La multiplicidad de nombres utilizados para describir la técnica ha causado cierta confusión y Verschueren ya la analizó en 1985. [8]
Para formar una imagen de la célula adherida, se pasa luz de una longitud de onda específica a través de un polarizador . Esta luz polarizada lineal es reflejada por un divisor de haz hacia el objetivo , que enfoca la luz en la muestra. La superficie del vidrio es reflectante hasta cierto punto y reflejará la luz polarizada. La luz que no es reflejada por el vidrio viajará hacia la célula y será reflejada por la membrana celular. Pueden ocurrir tres situaciones. Primero, cuando la membrana está cerca del vidrio, la luz reflejada del vidrio se desplaza la mitad de una longitud de onda, de modo que la luz reflejada desde la membrana tendrá un cambio de fase en comparación con la luz reflejada de las fases del vidrio y, por lo tanto, se cancelarán entre sí ( interferencia ). Esta interferencia da como resultado un píxel oscuro en la imagen final (el caso de la izquierda en la figura). Segundo, cuando la membrana no está unida al vidrio, el reflejo de la membrana tiene un cambio de fase más pequeño en comparación con la luz reflejada del vidrio y, por lo tanto, no se cancelarán entre sí, lo que da como resultado un píxel brillante en la imagen (el caso de la derecha en la figura). En tercer lugar, cuando no hay ninguna muestra, solo se detecta la luz reflejada del vidrio y aparecerá como píxeles brillantes en la imagen final.
La luz reflejada viajará de regreso al divisor de haz y pasará a través de un segundo polarizador, que elimina la luz dispersa, antes de llegar al detector (generalmente una cámara CCD ) para formar la imagen final. Los polarizadores pueden aumentar la eficiencia al reducir la luz dispersa; sin embargo, en una configuración moderna con una cámara digital sensible, no son necesarios. [9]
La reflexión se produce por un cambio en el índice de refracción, por lo que en cada límite se reflejará una parte de la luz. La cantidad de reflexión viene dada por el coeficiente de reflexión , según la siguiente regla: [8]
La reflectividad es una relación entre la intensidad de la luz reflejada ( ) y la intensidad de la luz entrante ( ): [8]
Utilizando índices de refracción típicos para el vidrio (1,50-1,54, ver lista ), agua (1,31, ver lista ), la membrana celular (1,48) [10] y el citosol (1,35), [10] se puede calcular la fracción de luz que se refleja en cada interfaz. La cantidad de reflexión aumenta a medida que aumenta la diferencia entre los índices de refracción, lo que da como resultado una gran reflexión de la interfaz entre la superficie del vidrio y el medio de cultivo (aproximadamente igual al agua: 1,31-1,33). Esto significa que sin una célula la imagen será brillante, mientras que cuando la célula está adherida, la diferencia entre el medio y la membrana causa una gran reflexión que está ligeramente desplazada en fase, causando interferencia con la luz reflejada por el vidrio. Debido a que la amplitud de la luz reflejada desde la interfaz medio-membrana disminuye debido a la dispersión, el área adherida aparecerá más oscura pero no completamente negra. Debido a que el cono de luz enfocado en la muestra da lugar a diferentes ángulos de luz incidente, existe una amplia gama de patrones de interferencia. Cuando los patrones difieren en menos de una longitud de onda (la franja de orden cero), los patrones convergen, lo que da como resultado una mayor intensidad. Esto se puede obtener utilizando un objetivo con una apertura numérica mayor que 1. [8]
Para obtener imágenes de células mediante IRM, un microscopio necesita al menos los siguientes elementos: 1) una fuente de luz, como una lámpara halógena, 2) un filtro óptico (que deja pasar un pequeño rango de longitudes de onda) y 3) un divisor de haz (que refleja el 50% y transmite el 50% de la longitud de onda elegida).
La fuente de luz debe producir luz de alta intensidad, ya que el divisor de haz y la muestra en sí perderán mucha luz. Diferentes longitudes de onda dan como resultado diferentes imágenes IRM; Bereiter-Hahn y colegas demostraron que para sus células PtK 2, la luz con una longitud de onda de 546 nm dio como resultado un mejor contraste que la luz azul con una longitud de onda de 436 nm. [7] Se han realizado muchos refinamientos a la teoría básica de IRM, la mayoría de los cuales aumentan la eficiencia y el rendimiento de la formación de imágenes. Al colocar polarizadores y una placa de cuarto de onda entre el divisor de haz y la muestra, la luz polarizada lineal se puede convertir en luz polarizada circular y luego volver a convertirse en luz polarizada lineal, lo que aumenta la eficiencia del sistema. El artículo sobre polarizador circular analiza este proceso en detalle. Además, al incluir un segundo polarizador, que se gira 90° en comparación con el primer polarizador, se puede evitar que la luz parásita llegue al detector, lo que aumenta la relación señal/ruido (consulte la Figura 2 de Verschueren [8] ).
Existen varias formas de utilizar la IRM para estudiar muestras biológicas. Los primeros ejemplos de usos de la técnica se centraron en la adhesión celular [1] y la migración celular [11] .
Más recientemente, la técnica se ha utilizado para estudiar la exocitosis en células cromafines . [9] Cuando se obtienen imágenes con DIC, las células cromafines aparecen como células redondas con pequeñas protuberancias. Cuando se obtienen imágenes de la misma célula con IRM, la huella de la célula en el vidrio se puede ver claramente como un área oscura con pequeñas protuberancias. Cuando las vesículas se fusionan con la membrana, aparecen como pequeños círculos claros dentro de la huella oscura (puntos brillantes en la célula superior en el panel derecho).
En la película 1 se muestra un ejemplo de fusión de vesículas en células cromafines mediante IRM. Tras la estimulación con 60 mM de potasio , comienzan a aparecer múltiples puntos brillantes dentro de la huella oscura de la célula cromafín como resultado de la exocitosis de los gránulos densos del núcleo. Debido a que la IRM no requiere una etiqueta fluorescente, se puede combinar con otras técnicas de imagen, como la epifluorescencia y la microscopía TIRF para estudiar la dinámica de las proteínas junto con la exocitosis y endocitosis de las vesículas. Otro beneficio de la falta de etiquetas fluorescentes es la reducción de la fototoxicidad .
