La complementación de fluorescencia bimolecular (también conocida como BiFC ) es una tecnología que se utiliza normalmente para validar las interacciones de proteínas . Se basa en la asociación de fragmentos de proteínas fluorescentes que se unen a componentes de un mismo complejo macromolecular . Las proteínas que se postula que interactúan se fusionan con fragmentos complementarios desplegados de una proteína indicadora fluorescente y se expresan en células vivas. La interacción de estas proteínas acercará los fragmentos fluorescentes, lo que permitirá que la proteína informadora se reforme en su estructura tridimensional nativa y emita su señal fluorescente. [1] Esta señal fluorescente se puede detectar y localizar dentro de la célula utilizando un microscopio de fluorescencia invertido que permite obtener imágenes de la fluorescencia en las células. Además, la intensidad de la fluorescencia emitida es proporcional a la fuerza de la interacción, donde niveles más fuertes de fluorescencia indican interacciones cercanas o directas y niveles de fluorescencia más bajos sugieren interacción dentro de un complejo. [2] Por lo tanto, a través de la visualización y el análisis de la intensidad y distribución de la fluorescencia en estas células, se puede identificar tanto la ubicación como las parejas de interacción de las proteínas de interés.
La complementación bioquímica se informó por primera vez en la ribonucleasa pancreática bovina escindida por subtilisina y luego se expandió utilizando mutantes de β-galactosidasa que permitieron que las células crecieran con lactosa. [3] [4] [5]
Posteriormente se informó sobre el reconocimiento de la capacidad de muchas proteínas para ensamblarse espontáneamente en complejos funcionales, así como de la capacidad de los fragmentos de proteínas para ensamblarse como consecuencia del ensamblaje complejo funcional espontáneo de los compañeros de interacción a los que están fusionados, para los fragmentos de ubiquitina en las interacciones entre proteínas de levadura. [6]
En 2000, Ghosh et al desarrollaron un sistema que permitía reensamblar una proteína verde fluorescente ( GFP ) utilizando una cremallera de leucina antiparalela en células de E. coli . [7] Esto se logró diseccionando GFP en fragmentos de GFP C y N-terminales . Como el fragmento de GFP estaba unido a cada cremallera de leucina mediante un conector, la heterodimerización de la cremallera de leucina antiparalela dio como resultado una proteína GFP reconstituida o reformada que podía visualizarse. La señal fluorescente exitosa indicó que los fragmentos separados del péptido GFP fueron capaces de reensamblarse correctamente y lograr el plegamiento terciario . Por lo tanto, se postuló que al utilizar esta técnica, la GFP fragmentada podría usarse para estudiar la interacción de pares proteína-proteína que tienen sus extremos N-C muy cerca.
Después de la demostración de la reconstitución exitosa de fragmentos de proteínas fluorescentes en células de mamíferos, Hu et al . describieron el uso de la proteína fluorescente amarilla fragmentada ( YFP ) en la investigación de las interacciones del factor de transcripción de la familia bZIP y Rel . [8] Este fue el primer informe sobre la regulación de la interacción de la proteína bZIP por regiones fuera del dominio bZIP , la regulación de la localización subnuclear de los dominios bZIP Fos y Jun por sus diferentes socios que interactúan y la modulación de la activación transcripcional de las proteínas bZIP y Rel a través de interacciones mutuas. . Además, este estudio fue el primer informe de una técnica in vivo , ahora conocida como ensayo de complementación de fluorescencia bimolecular (BiFC), para proporcionar información sobre las bases estructurales de la formación de complejos proteicos mediante la detección de la fluorescencia causada por el ensamblaje de la proteína indicadora fluorescente. fragmentos unidos a proteínas que interactúan. [8] [9]
La activación del fluoróforo se produce mediante una reacción de ciclación autocatalítica que se produce después de que la proteína se ha plegado correctamente. [10] Esto se avanzó con la reconstitución exitosa del fluoróforo YFP a partir de fragmentos de proteínas que se habían fusionado con proteínas que interactúan dentro de las 8 horas posteriores a la transfección, informada en 2002. [8]
Existen diferentes sistemas de producción que se pueden utilizar para la proteína de fusión generada. La expresión génica transitoria se utiliza para identificar interacciones proteína-proteína in vivo , así como en la localización subcelular del complejo BiFC. Sin embargo, hay que tener cuidado con la sobreexpresión de proteínas, ya que esto puede sesgar tanto la localización preferencial como los complejos proteicos predominantes formados. En cambio, se deben usar promotores débiles , el uso de niveles bajos de ADN plasmídico en la transfección y vectores plasmídicos que no se replican en células de mamíferos para expresar proteínas en o cerca de sus niveles endógenos para imitar el entorno celular fisiológico. [11] Además, es importante una selección cuidadosa de la proteína fluorescente, ya que diferentes proteínas fluorescentes requieren diferentes entornos celulares. Por ejemplo, GFP se puede utilizar en células de E. coli , mientras que YFP se utiliza en células de mamíferos. [12]
Las líneas celulares estables con el vector de expresión integrado en su genoma permiten una expresión genética más estable en la población celular, lo que da como resultado resultados más consistentes. [1]
Al decidir el sitio de fusión del conector en la superficie de la proteína, hay tres consideraciones principales. En primer lugar, los fragmentos de proteínas fluorescentes deben poder asociarse entre sí cuando sus proteínas unidas interactúan. [11] La información estructural y la ubicación de la superficie de interacción pueden ser útiles al determinar el sitio de fusión con el conector, aunque la información no es necesaria, ya que se pueden detectar múltiples combinaciones y permutaciones. [11] En segundo lugar, la creación de la proteína de fusión no debe alterar significativamente la localización, estabilidad o expresión de las proteínas a las que están unidos los fragmentos en comparación con las proteínas endógenas de tipo salvaje . [11] Finalmente, la adición de la fusión del fragmento fluorescente no debe afectar la función biológica de la proteína, preferiblemente verificada mediante ensayos que evalúen todas las funciones conocidas de las proteínas. [11]
Un conector es una secuencia corta de aminoácidos que une el fragmento de proteína indicadora fluorescente a la proteína de interés, formando la proteína de fusión. Al diseñar una secuencia conectora, se debe garantizar que el conector sea lo suficientemente soluble y largo para proporcionar a los fragmentos de proteína fluorescentes flexibilidad y libertad de movimiento, de modo que el fragmento y su fragmento asociado colisionen con la frecuencia suficiente para reconstituirse durante la interacción de sus respectivos fragmentos fusionados. proteínas. [1] Aunque no está documentado, es posible que la longitud o la secuencia del conector puedan influir en la complementación de algunas proteínas. [11] Las secuencias enlazadoras RSIAT y RPACKIPNDLKQKVMNH (código de aminoácido único) y AAANSSIDLISVPVDSR (Sigma) se han utilizado con éxito en experimentos de BiFC. [8] [13]
Al diseñar vectores plasmídicos para expresar las proteínas de interés, la construcción debe poder expresar proteínas que sean capaces de formar proteínas de fusión con fragmentos de proteínas fluorescentes sin alterar la función de la proteína. Además, el complejo proteico esperado debe poder aceptar la estabilización de la interacción del fragmento proteico fluorescente sin afectar la función del complejo proteico o la célula que se está estudiando. En BiFC se pueden utilizar muchos fragmentos de proteínas fluorescentes que se combinan de varias formas. [8] [13] Generalmente, se recomienda que YFP sirva como proteína indicadora, escindida en el residuo 155 (N-terminal que consta de los residuos 1 a 154 y C-terminal que consta de los residuos 155 a 238) o el residuo 173 en particular, como estos conjuntos de fragmentos son altamente eficientes en su complementación cuando se fusionan con muchas proteínas que interactúan y producen niveles bajos de fluorescencia cuando se fusionan con proteínas que no interactúan. Se sugiere que cada proteína diana se fusione a su vez con los fragmentos N y C-terminales de la proteína indicadora fluorescente, y que los fragmentos se fusionen en cada uno de los extremos N y C-terminales de las proteínas diana. Esto permitirá un total de ocho permutaciones diferentes, y se probarán las interacciones: [1]
Fragmento N-terminal fusionado en la proteína N-terminal 1 + fragmento C-terminal fusionado en la proteína N-terminal 2 Fragmento
N-terminal fusionado en la proteína N-terminal 1 + fragmento C-terminal fusionado en la proteína C-terminal 2
Fragmento N-terminal fusionado en la proteína C-terminal 1 + Fragmento C-terminal fusionado en la proteína N-terminal 2 Fragmento
N-terminal fusionado en la proteína C-terminal 1 + Fragmento C-terminal fusionado en la proteína C-terminal 2
Fragmento C-terminal fusionado en la proteína N-terminal 1 + Fragmento N-terminal fusionado en la proteína N-terminal 2 Fragmento
C-terminal fusionado en la proteína N-terminal 1 + Fragmento N-terminal fusionado en la proteína C-terminal 2
Fragmento C-terminal fusionado en la proteína C-terminal 1 + fragmento N-terminal fusionado en la proteína N-terminal 2 Fragmento
C-terminal fusionado en la proteína C-terminal 1 + fragmento N-terminal fusionado en la proteína C-terminal 2
Como se indicó anteriormente, es importante garantizar que la proteína indicadora fluorescente que se utiliza en BiFC sea apropiada y pueda expresarse en el sistema de cultivo celular elegido, ya que no todas las proteínas indicadoras pueden emitir fluorescencia o visualizarse en todos los sistemas modelo .
Los fragmentos de proteínas fluorescentes pueden asociarse y emitir fluorescencia con baja eficiencia en ausencia de una interacción específica. Por lo tanto, es importante incluir controles para garantizar que la fluorescencia de la reconstitución de la proteína indicadora fluorescente no se deba a un contacto inespecífico. [14]
Algunos controles incluyen fragmentos de fluoróforo unidos a proteínas que no interactúan, ya que la presencia de estas fusiones tiende a disminuir la complementación no específica y los resultados falsos positivos . [7]
Otro control se crea uniendo el fragmento de proteína fluorescente a proteínas con caras de interacción mutadas. [8] [13] Siempre que el fragmento fluorescente se fusione con las proteínas mutadas de la misma manera que la proteína de tipo salvaje, y los niveles de expresión genética y la localización no se vean afectados por la mutación , esto sirve como un fuerte control negativo. ya que las proteínas mutantes y, por tanto, los fragmentos fluorescentes, no deberían poder interactuar.
Los controles internos también son necesarios para normalizar las diferencias en la eficiencia de la transfección y la expresión genética en diferentes células. Esto se logra cotransfectando células con plásmidos que codifican las proteínas de fusión de interés, así como una proteína completa (no fragmentada) que emite fluorescencia a una longitud de onda diferente a la de la proteína indicadora fluorescente. Durante la visualización, se determinan las intensidades de fluorescencia del complejo BiFC y del control interno que, después de restar la señal de fondo, se convierte en una relación. Esta relación representa la eficiencia de BiFC y se puede comparar con otras relaciones para determinar las eficiencias relativas de la formación de diferentes complejos. [11]
Una vez diseñadas y generadas las proteínas de fusión y los controles en su sistema de expresión adecuado, se deben transfectar los plásmidos al interior de las células a estudiar. Después de la transfección, se debe esperar, normalmente unas ocho horas, para dar tiempo a que las proteínas de fusión interactúen y sus fragmentos de proteína indicadora fluorescente vinculados se asocien y emitan fluorescencia. [8]
Después de un tiempo suficiente para que las proteínas de fusión y sus fragmentos fluorescentes unidos interactúen y emitan fluorescencia, las células se pueden observar bajo un microscopio de fluorescencia invertido que puede visualizar la fluorescencia en las células. Aunque la intensidad de fluorescencia de los complejos BiFC suele ser <10% de la producida por la expresión de proteínas fluorescentes intactas, la autofluorescencia extremadamente baja en el rango visible de la mayoría de las células a menudo hace que la señal de BiFC sea de órdenes de magnitud mayor que la fluorescencia de fondo. [15]
Si se detecta fluorescencia cuando se expresan las proteínas de fusión, pero falta o se reduce significativamente después de la expresión del control negativo mutado, es probable que se produzca una interacción específica entre las dos proteínas diana de interés. Sin embargo, si la intensidad de la fluorescencia no es significativamente diferente entre la proteína de fusión de control negativo mutada y su contraparte de tipo salvaje, entonces la fluorescencia probablemente sea causada por interacciones de proteínas no específicas, por lo que se debe probar una combinación diferente de conformaciones de proteínas de fusión.
Si no se detecta fluorescencia, aún puede existir una interacción entre las proteínas de interés, ya que la creación de la proteína de fusión puede alterar la estructura o la cara de interacción de la proteína objetivo o los fragmentos de fluorescencia pueden no poder asociarse físicamente. Para garantizar que este resultado no sea un falso negativo , que no haya interacción, la interacción de la proteína debe probarse en una situación en la que la complementación y activación de la fluorescencia requiera una señal externa. En este caso, si la señal externa no logra provocar la asociación de fragmentos de fluorescencia, es probable que las proteínas no interactúen o que exista un impedimento físico para la complementación de la fluorescencia. [11]
Las proteínas interactúan con diferentes proteínas asociadas y otras macromoléculas para lograr funciones que respaldan diferentes funciones en las células que respaldan la supervivencia del organismo. La identificación de estas interacciones puede proporcionar pistas sobre sus efectos en los procesos celulares. Como estas interacciones pueden verse afectadas tanto por el entorno interno como por estímulos externos, estudiar estas interacciones in vivo y a niveles endógenos, como se recomienda en BiFC, proporciona un contexto fisiológicamente relevante del cual sacar conclusiones sobre las interacciones entre proteínas.
BiFC permite la visualización directa de las interacciones de proteínas en células vivas con una perturbación celular limitada , en lugar de depender de efectos secundarios o tinciones de moléculas exógenas que pueden no distribuirse uniformemente. [1] Esto, y la capacidad de observar las células vivas durante largos períodos de tiempo, es posible gracias a la fuerte fluorescencia intrínseca de la proteína indicadora reconstituida que reduce las posibilidades de una lectura incorrecta asociada con el proceso de aislamiento de proteínas. [1] [16]
A diferencia de muchos ensayos de interacción de proteínas in vivo , BiFC no requiere que se formen complejos de proteínas con una gran proporción de proteínas o en proporciones estequiométricas . En cambio, BiFC puede detectar interacciones entre subpoblaciones de proteínas , interacciones débiles y proteínas de baja expresión debido a la complementación estable de la proteína indicadora fluorescente. [12] [17] Además, se ha informado de una reconstitución exitosa de proteínas fluorescentes para proteínas asociadas con una separación de más de 7 nm, siempre que los conectores que unen el fragmento de fluoróforo a la proteína de interés tengan la flexibilidad necesaria para asociarse con su fragmento correspondiente. [14] Además, la fuerza de la interacción proteica se puede determinar cuantitativamente mediante cambios en la fuerza de la señal fluorescente. [2]
BiFC permite la medición de cambios espaciales y temporales en complejos proteicos, incluso en respuesta a fármacos activadores e inhibidores y de forma subcelular, proporcionando la resolución espacial más alta de los ensayos de interacción proteína-proteína in vivo . [8] [18] [19]
BiFC no requiere equipo especializado, ya que la visualización es posible con un microscopio de fluorescencia invertido que puede detectar la fluorescencia en las células. [14] Además, el análisis no requiere procesamiento de datos complejo ni corrección de otras fuentes de fluorescencia. [8]
BiFC se puede realizar sin información estructural sobre los socios de interacción, siempre que los fragmentos de proteína indicadora fluorescente puedan asociarse dentro del complejo, ya que se pueden detectar múltiples combinaciones de proteínas de fusión. Esto se debe a la suposición de que, dado que las funciones de las proteínas se recapitulan en el contexto in vivo , la estructura compleja se parecerá a la de las proteínas intactas vistas fisiológicamente. [15]
La tecnología BiFC se ha perfeccionado y ampliado para incluir la capacidad de visualizar simultáneamente múltiples complejos proteicos en la misma célula, interacciones ARN/proteína, detectar rápidamente cambios en las vías de transducción genética, demostrar fenotipos ocultos de fármacos, donde el resultado previsto del tratamiento (es decir, muerte celular, diferenciación, cambio morfológico) no se observa in vivo , estudia la formación de complejos en diferentes compartimentos celulares y mapea las superficies de interacción de proteínas [13] [19] [20] [21] [22]
La señal fluorescente sólo se produce después de que las proteínas han interactuado, lo que generalmente es del orden de horas. Por lo tanto, BiFC no puede proporcionar detección en tiempo real de interacciones entre proteínas. El retraso en las reacciones químicas para generar fluoróforos también puede tener un efecto en la dinámica de la disociación compleja y el intercambio de parejas. [1] [7] [8] [23]
La formación del complejo BiFC solo es reversible durante el paso inicial del reensamblaje de la proteína indicadora fluorescente, generalmente en el orden de milisegundos. Una vez reconstituido el fluorocromo, es esencialmente irreversible in vitro . Esto evita que las proteínas interactúen con otras y puede alterar la asociación/disociación de complejos proteicos en equilibrio dinámico . [1]
Los fragmentos de proteínas fluorescentes tienen una capacidad limitada para asociarse independientemente de las proteínas a las que están fusionados. Aunque la asociación independiente de proteínas variará según las identidades de las proteínas de fusión y sus niveles de expresión, se deben proporcionar los numerosos y necesarios controles para distinguir entre interacciones de proteínas verdaderas y falsas positivas. Generalmente, esta limitación se mitiga asegurando que las proteínas de fusión de interés se expresen en concentraciones endógenas. [1]
La unión de fragmentos fluorescentes puede alterar el plegamiento o la estructura de la proteína de interés, lo que lleva a la eliminación del sitio de unión a la superficie de una proteína que interactúa. Además, la disposición de los fragmentos fluorescentes puede impedir la reconstitución del fluoróforo mediante impedimento estérico , aunque el impedimento estérico puede reducirse o eliminarse mediante el uso de una secuencia conectora que permita suficiente flexibilidad para que se asocien los fragmentos fluorescentes. Por lo tanto, la ausencia de complementación de fluorescencia puede ser un falso negativo y no prueba necesariamente que no se produzca la interacción en cuestión.
Debido al requerimiento de oxígeno molecular para la formación de fluoróforos, BiFC no se puede utilizar en anaerobios obligados , que no pueden sobrevivir en presencia de oxígeno. Esto limita el uso de BiFC a organismos aeróbicos . [1]
La autofluorescencia no suele ser un problema ya que la señal BiFC será mucho más alta que la del fondo. [24] [25] Sin embargo, ciertos organismos, especialmente apicomplexa , tienen una autofluorescencia más alta que dificulta la aplicación de BiFC en ellos. [26] Ciertos hongos, como Candida albicans , también tienen un alto fondo autofluorescente, pero BiFC a menudo aún se puede realizar cuando se utilizan los controles y cepas adecuados. [27] [28]
Debido a que las proteínas endógenas de tipo salvaje no se pueden visualizar in vivo , se deben crear proteínas de fusión y transfectar sus plásmidos en las células estudiadas. Es posible que estas proteínas de fusión no recapitulen las funciones, localización e interacciones comunes a sus contrapartes de tipo salvaje, lo que proporciona una imagen inexacta de las proteínas en cuestión. Este problema se puede aliviar usando información estructural y la ubicación de los sitios de interacción para identificar racionalmente los sitios de fusión en las proteínas de interés, usando controles apropiados y comparando los niveles de expresión y funciones de las proteínas de fusión y de tipo salvaje mediante Western Blots y funcionales. ensayos. [1]
Aunque las bajas temperaturas favorecen la reconstitución de la fluorescencia cuando los fragmentos están cerca, esto puede afectar el comportamiento de las proteínas objetivo, lo que lleva a conclusiones inexactas sobre la naturaleza de las interacciones de las proteínas y sus parejas que interactúan. [17]
Debido a que la reconstitución del fluoróforo puede ocurrir a una distancia de 7 nm o más, la complementación de la fluorescencia puede indicar una interacción directa o indirecta (es decir, dentro del mismo complejo) entre las proteínas fusionadas de los fragmentos fluorescentes. [dieciséis]
Además de la validación de las interacciones proteína-proteína descritas anteriormente, BiFC se ha ampliado y adaptado a otras aplicaciones:
El sistema BiFC se ha aplicado para registrar eventos de biogénesis de ribosomas en E. coli . [29] El proceso de ensamblaje de ribosomas implica la nucleación de proteínas ribosómicas en el orden y orientación adecuados. Las perturbaciones en el ensamblaje pueden provocar defectos estructurales en las subunidades ribosómicas que, como resultado, no pueden unirse en la orientación correcta para formar ribosomas completamente funcionales. Por lo tanto, los eventos de unión de subunidades señalados por la aparición de BiFC son una manera fácil de monitorear la biogénesis de ribosomas en contraste con los laboriosos métodos de elaboración de perfiles de polisomas.
Los fragmentos de proteínas fluorescentes utilizados en BiFC se han ampliado para incluir los colores azul, cian, verde, amarillo, rojo, cereza y Venus . [8] [13] [30] [31] Esta gama de colores ha hecho posible el desarrollo del análisis de complementación de fluorescencia multicolor. [13] Esta técnica permite visualizar múltiples complejos de proteínas simultáneamente en la misma célula. Además, las proteínas suelen tener una gran cantidad de compañeros de interacción alternativos. Por lo tanto, al fusionar fragmentos de diferentes proteínas fluorescentes con proteínas candidatas, se puede estudiar la competencia entre socios de interacción alternativos para la formación de complejos mediante la complementación de diferentes fragmentos de colores fluorescentes. [13]
BiFC se ha ampliado para incluir el estudio de las interacciones de las proteínas de unión al ARN en un método que Rackham y Brown describieron como complementación de fluorescencia trimolecular (TriFC). [20] En este método, un fragmento de la proteína fluorescente de Venus se fusiona con el ARNm de interés y la porción complementaria de Venus se fusiona con la proteína de unión a ARN de interés. De manera similar a BiFC, si el ARNm y la proteína interactúan, la proteína Venus se reconstituirá y emitirá fluorescencia. También conocido como método del puente de ARN, ya que el fluoróforo y otras proteínas que interactúan forman un puente entre la proteína y el ARN de interés, esto permite una detección y localización simples de las interacciones ARN-proteína dentro de una célula viva y proporciona un método simple para detectar Asociación directa o indirecta de ARN-proteína (es decir, dentro de un complejo) que puede verificarse mediante análisis in vitro de compuestos purificados o eliminación de ARNi de las moléculas puente. [20]
BiFC se puede utilizar para vincular genes entre sí y su función mediante la medición de interacciones entre las proteínas que codifican los genes. [21] [22] Esta aplicación es ideal para genes nuevos en los que se sabe poco acerca de sus efectores ascendentes y descendentes , ya que se pueden establecer nuevos enlaces de vías. Además, los efectos de los fármacos, las hormonas o la eliminación o desactivación del gen de interés, y los efectos posteriores tanto en la fuerza de las interacciones proteína-proteína como en la ubicación de la interacción, se pueden observar en cuestión de segundos. [18] [19]
BiFC se ha utilizado para estudiar la translocación nuclear , mediante localización compleja, así como interacciones que involucran proteínas integrales de membrana . [8] [32] [33] [34] [35] [36] [37] [38] Por lo tanto, BiFC es una herramienta importante para comprender la localización del factor de transcripción en compartimentos subcelulares.
BiFC se ha combinado con citometría de flujo (BiFC-FC). Esto permite mapear las superficies de interacción proteína-proteína mediante la introducción de mutaciones aleatorias o dirigidas al sitio que afectan la formación de complejos. [2]
La mayoría de las técnicas utilizadas para estudiar las interacciones proteína-proteína se basan en métodos in vitro . Desgraciadamente, el estudio de las proteínas en un sistema artificial, fuera de su entorno celular, plantea una serie de dificultades. Por ejemplo, esto puede requerir la eliminación de proteínas de su entorno celular normal. El procesamiento necesario para aislar la proteína puede afectar sus interacciones con otras proteínas. Además, aislar la proteína de la señalización intracelular y de los mecanismos que ocurren en la célula normal puede proporcionar una imagen engañosa de los acontecimientos intracelulares y fisiológicos. [1] Además, las proteínas estudiadas in vitro pueden estudiarse en concentraciones muy diferentes de sus niveles de abundancia normales, pueden no necesariamente transportarse de manera eficiente a las células o pueden no ser lo suficientemente selectivas para funcionar en el genoma del huésped. [39] [40] [41] [42] Finalmente, al estudiar las proteínas in vitro , no se puede determinar la influencia de las interacciones proteína-proteína específicas en la célula sobre las consecuencias funcionales o fisiológicas.
Otros ensayos in vivo utilizados más comúnmente para estudiar las interacciones proteína-proteína incluyen la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia ( FRET ) y el ensayo de dos híbridos de levadura ( Y2H ). Cada uno de estos ensayos tiene sus ventajas y desventajas en comparación con BiFC:
La transferencia de energía por resonancia de fluorescencia ( FRET ), también conocida como transferencia de energía por resonancia förster , transferencia de energía por resonancia ( RET ) o transferencia de energía electrónica ( EET ), se basa en la transferencia de energía de un cromóforo o fluoróforo excitado ( donante ) (si los cromóforos son fluorescentes) a un aceptor cercano . En este método, los fluoróforos están vinculados químicamente o fusionados genéticamente a dos proteínas que, según la hipótesis, interactúan. Si las proteínas interactúan, esto hará que los fluoróforos se acerquen espacialmente. Si los fluoróforos están orientados de una manera que los expone entre sí, lo que generalmente se garantiza al diseñar y construir el enlace/fusión fluoróforo-proteína, entonces la transferencia de energía desde el fluoróforo donante excitado dará como resultado un cambio en las intensidades o tiempos de vida de la fluorescencia. de los fluoróforos. [1] [14]
El doble híbrido de levadura ( Y2H ) es una técnica de detección genética que se puede utilizar para detectar interacciones físicas (de unión) proteína-proteína o proteína-ADN . Generalmente se aplica en el organismo de levadura modelo Saccharomyces cerevisiae . Prueba una proteína 'cebo' de función (des)conocida que está fusionada, por ejemplo, al dominio de unión del factor de transcripción GAL4 frente a posibles proteínas que interactúan o una biblioteca de ADNc que expresa, por ejemplo, el dominio de activación de GAL4 (el ' presa'). [43] [44]