La IUPAC define los términos glicanos y polisacáridos como sinónimos que significan "compuestos que consisten en una gran cantidad de monosacáridos unidos glicosídicamente". [1] Sin embargo, en la práctica el término glicano también se puede utilizar para referirse a la porción de carbohidrato de un glicoconjugado , como una glicoproteína , un glicolípido o un proteoglicano , incluso si el carbohidrato es solo un oligosacárido . [2] Los glicanos generalmente consisten únicamente en enlaces O-glucosídicos de monosacáridos. Por ejemplo, la celulosa es un glicano (o, para ser más específico, un glucano ) compuesto de D -glucosa unida a β-1,4 , y la quitina es un glicano compuesto de N -acetil- D unida a β-1,4. -glucosamina. Los glicanos pueden ser homo o heteropolímeros de residuos de monosacáridos y pueden ser lineales o ramificados.
Los glicanos se pueden encontrar unidos a proteínas como en las glicoproteínas y los proteoglicanos. En general, se encuentran en la superficie exterior de las células. Los glicanos unidos a O y N son muy comunes en eucariotas pero también pueden encontrarse, aunque con menos frecuencia, en procariotas .
Los glicanos unidos a N están unidos en el retículo endoplásmico al nitrógeno (N) en la cadena lateral de la asparagina (Asn) en el sequon . La secuencia es una secuencia Asn-X-Ser o Asn-X-Thr, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina y el glicano puede estar compuesto de N -acetilgalactosamina , galactosa , ácido neuramínico , N -acetilglucosamina , fucosa , manosa y otros monosacáridos.
En eucariotas, los glicanos unidos a N se derivan de una unidad central de 14 azúcares ensamblada en el citoplasma y el retículo endoplásmico . Primero, dos residuos de N -acetilglucosamina se unen al monofosfato de dolicol , un lípido, en el lado externo de la membrana del retículo endoplásmico. Luego se añaden cinco residuos de manosa a esta estructura. En este punto, el glicano central parcialmente terminado se voltea a través de la membrana del retículo endoplásmico, de modo que ahora esté ubicado dentro de la luz reticular. Luego, el ensamblaje continúa dentro del retículo endoplásmico, con la adición de cuatro residuos de manosa más. Finalmente, a esta estructura se le añaden tres residuos de glucosa. Después del ensamblaje completo, el glucano es transferido en bloque por la glicosiltransferasa oligosacariltransferasa a una cadena peptídica naciente, dentro de la luz reticular. Esta estructura central de los glicanos unidos a N, por tanto, consta de 14 residuos (3 glucosa, 9 manosa y 2 N -acetilglucosamina).
Imagen: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=glico.figgrp.469
Los cuadrados oscuros son N -acetilglucosamina; los círculos claros son manosa; los triángulos oscuros son glucosa.
Una vez transferidos a la cadena peptídica naciente, los glicanos unidos a N, en general, se someten a extensas reacciones de procesamiento, mediante las cuales se eliminan los tres residuos de glucosa, así como varios residuos de manosa, dependiendo del glicano unido a N en cuestión. La eliminación de los residuos de glucosa depende del plegamiento adecuado de las proteínas. Estas reacciones de procesamiento ocurren en el aparato de Golgi . Las reacciones de modificación pueden implicar la adición de un grupo fosfato o acetilo a los azúcares, o la adición de nuevos azúcares, como el ácido neuramínico . El procesamiento y modificación de los glicanos unidos a N dentro del Golgi no sigue una ruta lineal. Como resultado, son posibles muchas variaciones diferentes de la estructura de los glucanos unidos a N, dependiendo de la actividad enzimática en el Golgi.
Los glicanos unidos a N son extremadamente importantes en el plegamiento adecuado de proteínas en células eucariotas. Las proteínas chaperonas del retículo endoplásmico, como la calnexina y la calreticulina , se unen a los tres residuos de glucosa presentes en el glicano central unido a N. Estas proteínas chaperonas sirven para ayudar en el plegamiento de la proteína a la que está unido el glicano. Después de un plegado adecuado, se eliminan los tres residuos de glucosa y el glicano pasa a reacciones de procesamiento adicionales. Si la proteína no se pliega correctamente, los tres residuos de glucosa se vuelven a unir, lo que permite que la proteína se vuelva a asociar con las chaperonas. Este ciclo puede repetirse varias veces hasta que una proteína alcance su conformación adecuada. Si una proteína falla repetidamente en plegarse adecuadamente, se excreta del retículo endoplásmico y se degrada por las proteasas citoplasmáticas.
Los glicanos unidos a N también contribuyen al plegamiento de proteínas mediante efectos estéricos. Por ejemplo, los residuos de cisteína en el péptido pueden bloquearse temporalmente para que no formen enlaces disulfuro con otros residuos de cisteína, debido al tamaño de un glicano cercano. Por lo tanto, la presencia de un glicano unido a N permite a la célula controlar qué residuos de cisteína formarán enlaces disulfuro.
Los glicanos unidos a N también desempeñan un papel importante en las interacciones entre células. Por ejemplo, las células tumorales producen glicanos unidos a N que son anormales. Estos son reconocidos por el receptor CD337 de las células Natural Killer como una señal de que la célula en cuestión es cancerosa.
Dentro del sistema inmunológico, los glicanos unidos a N en la superficie de una célula inmune ayudarán a dictar ese patrón de migración de la célula; por ejemplo, las células inmunes que migran a la piel tienen glicosilaciones específicas que favorecen su localización en ese sitio. [3] Los patrones de glicosilación de las diversas inmunoglobulinas, incluidas IgE, IgM, IgD, IgE, IgA e IgG, les confieren funciones efectoras únicas al alterar sus afinidades por Fc y otros receptores inmunitarios. [3] Los glicanos también pueden estar involucrados en la discriminación entre lo "propio" y lo "no propio", lo que puede ser relevante para la fisiopatología de diversas enfermedades autoinmunes; [3] incluida la artritis reumatoide [4] y la diabetes tipo 1. [5]
El objetivo de las enzimas lisosomales degradativas también se logra mediante glicanos unidos a N. La modificación de un glicano unido a N con un residuo de manosa-6-fosfato sirve como señal de que la proteína a la que está unido este glicano debe trasladarse al lisosoma. Este reconocimiento y tráfico de enzimas lisosomales por la presencia de manosa-6-fosfato se logra mediante dos proteínas: CI-MPR ( receptor de manosa-6-fosfato independiente de cationes ) y CD-MPR (receptor de manosa-6-fosfato dependiente de cationes). ).
En eucariotas, los glicanos unidos por O se ensamblan un azúcar a la vez en un residuo de serina o treonina de una cadena peptídica en el aparato de Golgi. A diferencia de los glicanos unidos a N , todavía no se conoce una secuencia consenso . Sin embargo, la colocación de un residuo de prolina en -1 o +3 con respecto a la serina o treonina es favorable para la glicosilación ligada a O.
El primer monosacárido unido en la síntesis de glicanos unidos a O es la N-acetil-galactosamina. Después de esto, son posibles varios caminos diferentes. Se genera una estructura Core 1 mediante la adición de galactosa. Se genera una estructura Core 2 mediante la adición de N-acetil-glucosamina a la N-acetil-galactosamina de la estructura Core 1. Las estructuras del núcleo 3 se generan mediante la adición de una única N-acetil-glucosamina a la N-acetil-galactosamina original. Las estructuras Core 4 se generan mediante la adición de una segunda N-acetil-glucosamina a la estructura Core 3. Otras estructuras centrales son posibles, aunque menos comunes.
Imágenes:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=glico.figgrp.561: Generación Core 1 y Core 2. Cuadrado blanco = N-acetil-galactosamina; círculo negro = galactosa; Cuadrado negro = N-acetil-glucosamina. Nota: Hay un error en este diagrama. El cuadrado inferior siempre debe ser blanco en cada imagen, no negro.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=glico.figgrp.562: Generación Core 3 y Core 4.
Un tema estructural común en los glicanos unidos por O es la adición de unidades de polilactosamina a las diversas estructuras centrales. Estos se forman mediante la adición repetitiva de unidades de galactosa y N-acetil-glucosamina. Las cadenas de polilactosamina en glicanos unidos por O a menudo están cubiertas por la adición de un residuo de ácido siálico (similar al ácido neuramínico). Si también se añade un residuo de fucosa , al penúltimo residuo, se forma una estructura Sialyl-Lewis X (SLex).
Sialyl lewis x es importante en la determinación del antígeno sanguíneo ABO .
SLex también es importante para una respuesta inmune adecuada. La liberación de P- selectina de los cuerpos de Weibel-Palade , en las células endoteliales de los vasos sanguíneos, puede ser inducida por varios factores. Uno de esos factores es la respuesta de la célula endotelial a ciertas moléculas bacterianas, como el peptidoglicano . La selectina P se une a la estructura SLex que está presente en los neutrófilos en el torrente sanguíneo y ayuda a mediar la extravasación de estas células al tejido circundante durante la infección.
Se ha descubierto que los glicanos unidos a O , en particular la mucina , son importantes en el desarrollo de la microflora intestinal normal. Ciertas cepas de bacterias intestinales se unen específicamente a la mucina, lo que les permite colonizar el intestino.
Ejemplos de glicoproteínas unidas a O son:
Otro tipo de glucano celular son los glucosaminoglicanos (GAG). Estos comprenden 2-aminoazúcares unidos de forma alterna con ácidos urónicos e incluyen polímeros como heparina , heparán sulfato , condroitina , queratan y dermatan . Algunos glucosaminoglicanos, como el heparán sulfato, se encuentran adheridos a la superficie celular, donde se unen a través de un conector tetrasacárido a través de un residuo xilosil a una proteína (formando una glicoproteína o proteoglicano ).
Un informe de 2012 del Consejo Nacional de Investigación de EE. UU. pide un nuevo enfoque en la glicociencia, un campo que explora las estructuras y funciones de los glicanos y promete grandes avances en áreas tan diversas como la medicina, la generación de energía y la ciencia de los materiales. [6] Hasta ahora, los glicanos han recibido poca atención por parte de la comunidad investigadora debido a la falta de herramientas para investigar sus estructuras y propiedades, a menudo complejas. [7] El informe presenta una hoja de ruta para transformar la glicociencia de un campo dominado por especialistas a una disciplina ampliamente estudiada e integrada.
Ver glicolípidos
Los siguientes son ejemplos de las técnicas comúnmente utilizadas en el análisis de glucanos: [8] [9]
Los métodos más comúnmente aplicados son MS y HPLC , en los que la parte de glicano se escinde enzimática o químicamente del objetivo y se somete a análisis. [10] En el caso de los glicolípidos, se pueden analizar directamente sin separación del componente lipídico.
Los N- glicanos de las glicoproteínas se analizan de forma rutinaria mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (fase reversa, fase normal y HPLC de intercambio iónico) después de marcar el extremo reductor de los azúcares con un compuesto fluorescente (marcaje reductor). [11] En los últimos años se introdujo una gran variedad de etiquetas diferentes, donde 2-aminobenzamida (AB), ácido antranílico (AA), 2-aminopiridina (PA), 2-aminoacridona (AMAC) y 3-(acetilamino)- La 6-aminoacridina (AA-Ac) son sólo algunos de ellos. [12] Se deben utilizar diferentes etiquetas para diferentes modos ESI y sistemas MS utilizados. [13]
Los O- glicanos generalmente se analizan sin etiquetas, debido a las condiciones de liberación química que impiden su etiquetado.
Los glicanos fraccionados de instrumentos de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) se pueden analizar más a fondo mediante MALDI -TOF-MS(MS) para obtener más información sobre la estructura y la pureza. A veces, los grupos de glicanos se analizan directamente mediante espectrometría de masas sin prefraccionamiento, aunque la discriminación entre estructuras de glicanos isobáricos es más desafiante o incluso no siempre es posible. De todos modos, el análisis directo MALDI -TOF-MS puede conducir a una ilustración rápida y sencilla del conjunto de glucanos. [14]
En los últimos años, la cromatografía líquida de alta resolución en línea acoplada a la espectrometría de masas se ha vuelto muy popular. Al elegir carbono grafítico poroso como fase estacionaria para la cromatografía líquida, se pueden analizar incluso glicanos no derivatizados. En este caso, la detección se realiza mediante espectrometría de masas, pero en lugar de MALDI -MS, se utiliza con mayor frecuencia la ionización por electropulverización ( ESI ). [15] [16] [17]
Aunque MRM se ha utilizado ampliamente en metabolómica y proteómica, su alta sensibilidad y respuesta lineal en un amplio rango dinámico lo hacen especialmente adecuado para la investigación y el descubrimiento de biomarcadores de glicanos. MRM se realiza en un instrumento de triple cuadrupolo (QqQ), que está configurado para detectar un ion precursor predeterminado en el primer cuadrupolo, un ion fragmentado en el cuadrupolo de colisión y un ion fragmentado predeterminado en el tercer cuadrupolo. Es una técnica sin escaneo, en la que cada transición se detecta individualmente y la detección de múltiples transiciones ocurre simultáneamente en ciclos de trabajo. Esta técnica se está utilizando para caracterizar el glucoma inmunológico. [3] [18]
Tabla 1 : Ventajas y desventajas de la espectrometría de masas en el análisis de glicanos.
Las matrices de lectinas y anticuerpos proporcionan una detección de alto rendimiento de muchas muestras que contienen glicanos. Este método utiliza lectinas naturales o anticuerpos monoclonales artificiales , donde ambos se inmovilizan en un chip determinado y se incuban con una muestra de glicoproteína fluorescente.
Las matrices de glicanos, como la que ofrecen el Consortium for Functional Glycomics y Z Biotech LLC, contienen compuestos de carbohidratos que pueden detectarse con lectinas o anticuerpos para definir la especificidad de los carbohidratos e identificar ligandos.
El etiquetado metabólico de los glicanos se puede utilizar como una forma de detectar estructuras de glicanos. Una estrategia bien conocida implica el uso de azúcares marcados con azida que pueden hacerse reaccionar mediante la ligadura de Staudinger . Este método se ha utilizado para obtener imágenes de glicanos in vitro e in vivo.
La cristalografía de rayos X y la espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) para el análisis estructural completo de glicanos complejos es un campo difícil y complejo. Sin embargo, la estructura del sitio de unión de numerosas lectinas , enzimas y otras proteínas de unión a carbohidratos ha revelado una amplia variedad de bases estructurales para la función del glicoma. La pureza de las muestras de prueba se ha obtenido mediante cromatografía ( cromatografía de afinidad , etc.) y electroforesis analítica ( PAGE (electroforesis de poliacrilamida) , electroforesis capilar , electroforesis de afinidad , etc.).