Los receptores de manosa 6-fosfato ( MPR ) son glicoproteínas transmembrana que dirigen enzimas a los lisosomas en los vertebrados . [1]
Los receptores de manosa 6-fosfato se unen a las hidrolasas lisosomales recién sintetizadas en la red trans-Golgi (TGN) y las entregan a los compartimentos prelisosomales. Hay dos MPR diferentes, uno de ~300 kDa y un receptor dimérico más pequeño de ~46 kDa. [2] [3] El receptor más grande se conoce como receptor de manosa 6-fosfato independiente de cationes ( CI-MPR ), mientras que el receptor más pequeño ( CD-MPR ) requiere cationes divalentes para reconocer de manera eficiente las hidrolasas lisosomales. [3] Si bien los cationes divalentes no son esenciales para la unión del ligando por el CD-MPR humano, se ha conservado la nomenclatura. [4]
Ambos receptores se unen a la manosa 6-fosfato terminal con una afinidad similar (CI-MPR = 7 μM, CD-MPR = 8 μM) [5] y tienen señales similares en sus dominios citoplasmáticos para el tráfico intracelular. [6]
Elizabeth Neufeld estaba estudiando pacientes que tenían múltiples cuerpos de inclusión presentes en sus células . [7] Debido a la gran cantidad de cuerpos de inclusión, denominó esta afección enfermedad de células I. Estos cuerpos de inclusión representaban lisosomas que estaban llenos de material no digerible. Al principio, Neufeld pensó que estos pacientes debían tener una falta de enzimas lisosomales . . . Estudios posteriores mostraron que se estaban produciendo todas las enzimas lisosomales , pero se estaban dirigiendo incorrectamente . En lugar de enviarse al lisosoma , se estaban secretando. Además, se descubrió que estas enzimas mal dirigidas no estaban fosforiladas . Por lo tanto, Neufeld sugirió que la enfermedad de células I era causada por una deficiencia en las enzimas que agregan una etiqueta específica de manosa 6-fosfato a las enzimas lisosomales para que puedan dirigirse al lisosoma .
Los estudios de la enfermedad de las células I condujeron al descubrimiento de los receptores que se unen a esta etiqueta específica. En primer lugar, se descubrió y aisló el CI-MPR mediante el uso de cromatografía de afinidad . Sin embargo, los científicos descubrieron que algunas de las enzimas lisosomales aún alcanzaban el lisosoma en ausencia del CI-MPR. Esto condujo a la identificación de otro receptor de unión a manosa 6-fosfato , el CD-MPR, que se une a su ligando en presencia de un catión divalente como Mn 2+ . [8] [9]
Se han clonado y caracterizado los genes de cada receptor . Se cree que han evolucionado a partir del mismo gen ancestral, ya que existe una conservación en algunos de sus límites intrón / exón y existe una homología en sus dominios de unión . [7]
La función principal de los MPR es dirigir las enzimas lisosomales al lisosoma .
Las enzimas lisosomales se sintetizan en el retículo endoplasmático rugoso junto con una variedad de otras proteínas secretoras . Se ha desarrollado una etiqueta de reconocimiento específica para evitar que se secreten estas enzimas lisosomales dañinas y para garantizar que se dirijan al lisosoma. [7] Esta etiqueta es un residuo de manosa 6-fosfato.
Una vez que la enzima lisosomal ha sido translocada al retículo endoplásmico rugoso, un oligosacárido compuesto de Glc 3 Man 9 GlcNAc 2 se transfiere en bloque a la proteína. [1] El oligosacárido presente en las enzimas lisosomales se procesa de la misma manera que otras proteínas secretoras mientras se transloca desde el retículo endoplásmico al cis -Golgi .
En el trans -Golgi , una fosfotransferasa GlcNAc (EC 2.7.8.17) añade un residuo de fosfato GlcNAc -1- al grupo 6-hidroxilo de un residuo de manosa específico dentro del oligosacárido . [10] Esto forma un fosfodiéster : Man-fosfato-GlcNAc. Una vez que se ha formado el fosfodiéster, la enzima lisosomal se translocará a través del aparato de Golgi hasta el trans -Golgi . En el trans -Golgi, una fosfodiesterasa (EC 3.1.4.45) eliminará el residuo de GlcNAc exponiendo la etiqueta de 6-fosfato de manosa, lo que permite que las enzimas lisosomales se unan al CI-MPR y al CD-MPR. El complejo MPR-enzima lisosomal se transloca a un compartimento prelisosomal, conocido como endosoma , en una vesícula recubierta de COPII . [11] [12] Esta orientación fuera de la vía secretora se logra mediante la presencia de una señal de clasificación específica, un motivo de grupo ácido/dileucina, en las colas citoplasmáticas de los MPR. [13] Ambos MPR se unen a sus ligandos de manera más efectiva a pH 6 – 7; permitiendo así que los receptores se unan a las enzimas lisosomales en el trans -Golgi y las liberen en el entorno acidificado del endosoma . Una vez que la enzima se ha disociado del receptor de manosa 6-fosfato, se transloca del endosoma al lisosoma donde se elimina la etiqueta de fosfato de la enzima .
Los MPR no se encuentran en los lisosomas ; circulan principalmente entre la red trans -Golgi y los endosomas . El CI-MPR también está presente en la superficie celular . Alrededor del 10-20% del CI-MPR se puede encontrar en la membrana celular. [14] Su función aquí es capturar cualquier enzima marcada con manosa 6-fosfato que haya ingresado accidentalmente en la vía secretora. Una vez que se une a una enzima lisosomal, el receptor se internaliza rápidamente. La internalización está mediada por una señal de clasificación en su cola citoplasmática: un motivo YSKV. [13] Esto asegura que todas las enzimas lisosomales dañinas se dirigirán al lisosoma .
CI-MPR
Los ratones que carecen del CI-MPR mueren el día 15 de gestación debido a hiperplasia cardíaca . [7] Los ratones sufren un crecimiento anormal porque no pueden regular los niveles de IGF-II libre (factor de crecimiento similar a la insulina tipo II). La muerte de los ratones se puede prevenir si también se elimina el alelo IGF-II . Un análisis posterior de los embriones también mostró que presentan defectos en la orientación de las enzimas lisosomales , ya que tienen un mayor nivel de enzimas lisosomales fosforiladas en su líquido amniótico . Aproximadamente el 70% de las enzimas lisosomales se secretan en ausencia del CI-MPR, lo que sugiere que el CD-MPR es incapaz de compensar su pérdida. [1]
CD-MPR
Cuando se elimina el CD-MPR de los ratones, estos parecen sanos, salvo por el hecho de que tienen defectos en la orientación de múltiples enzimas lisosomales . Estos ratones presentan niveles elevados de enzimas lisosomales fosforiladas en la sangre y acumulan material no digerido en sus lisosomas . [7]
A partir de estos ratones knockout se puede deducir que ambos receptores son necesarios para la focalización eficiente de las enzimas lisosomales . Las enzimas lisosomales que son secretadas por las dos líneas celulares knockout diferentes forman dos conjuntos diferentes. Esto sugiere que cada MPR interactúa preferentemente con un subconjunto de enzimas lisosomales .
El CI-MPR y el CD-MPR son receptores estructuralmente distintos , pero comparten una estructura general, ya que ambos son proteínas integrales de membrana de tipo I. Ambos receptores tienen un gran dominio extracitoplasmático N-terminal , un dominio transmembrana y una cola citoplasmática C-terminal corta . Estas colas citoplasmáticas contienen múltiples señales de clasificación; [15] algunas de las cuales pueden estar fosforiladas o palmitoiladas . [13]
CI-MPR : El CI-MPR tiene ~300 kDa. [16] El dominio extracitoplasmático N-terminal contiene 15 dominios de reconocimiento de carbohidratos de tipo P contiguos. [16] Se los conoce como dominios MRH (homología del receptor de manosa 6-fosfato). Los dominios son homólogos porque tienen:
Se ha determinado la estructura de 7 de los 15 dominios, utilizando cristalografía de rayos X , y parecen compartir un pliegue similar . [16] El CI-MPR existe principalmente como un dímero en la membrana . Se ha descubierto que los dominios 3, 5 y 9 se unen a la manosa 6-fosfato. Los dominios 3 y 9 pueden unirse a la manosa 6-fosfato con alta afinidad . El dominio 5 solo se une a Man-6-fosfato con una afinidad débil . Sin embargo, también se ha demostrado que el dominio 5 se une al fosfodiéster, Man-fosfato-GlcNAc. [16] Este es un mecanismo de seguridad para la célula: significa que puede unirse a enzimas lisosomales que han escapado a la acción de la enzima que elimina el residuo de GlcNAc . La combinación de estos 3 dominios permite que el CI-MPR se una a una amplia gama de estructuras de glicano fosforiladas . El dominio 11 se une a IGF-II .
CD-MPR : El CD-MPR es mucho más pequeño que el CI-MPR: solo pesa ~46 kDa. [16] Su dominio extracitoplasmático N-terminal contiene solo 1 dominio de reconocimiento de carbohidratos de tipo P. El CD-MPR existe principalmente como un dímero en la membrana . Sin embargo, también se cree que existen formas monoméricas y tetraméricas . [17] El equilibrio entre estos diferentes oligómeros se ve afectado por el pH , la temperatura y la presencia de residuos de manosa 6-fosfato. Cada monómero forma un barril β de 9 hebras que puede unirse a un solo residuo de manosa 6-fosfato.
El CI-MPR y el CD-MPR se unen a la manosa 6-fosfato de manera similar. Ambos forman un conjunto de enlaces de hidrógeno entre residuos clave y grupos hidroxilo característicos en el residuo de manosa . Los enlaces de hidrógeno a los grupos hidroxilo en las posiciones 2, 3 y 4 hacen que el sitio sea específico para la manosa sola.
Ambos MPR comparten 4 residuos que son esenciales para la unión del ligando . La mutación de cualquiera de estos residuos da como resultado la pérdida de la unión de la manosa 6-fosfato. [16] Estos residuos son glutamina , arginina , ácido glutámico y tirosina y son responsables de formar los enlaces de hidrógeno que contactan grupos hidroxilo específicos en el residuo de manosa .
En las enzimas lisosomales puede haber una amplia variedad de estructuras de N-glicano . Estos glicanos pueden variar en:
El CI-MPR y el CD-MPR pueden unirse a esta amplia gama de estructuras de N-glicano al tener una arquitectura de sitio de unión diferente. [1] Los MPR también se unen al grupo fosfato de una manera ligeramente diferente. El dominio 3 del CI-MPR usa Ser -386 y una molécula de agua ordenada para unirse a la fracción fosfato . Por otro lado, el CD-MPR usa los residuos Asp -103, Asn -104 y His -105 para formar enlaces de hidrógeno favorables con el grupo fosfato . [16] El CD-MPR también contiene un catión divalente Mn2 + que forma enlaces de hidrógeno favorables con la fracción fosfato .
Está bien establecido que el CI-MPR se une a la manosa 6-fosfato, pero hay un creciente cuerpo de evidencia que sugiere que el CI-MPR también se une al IGF-II no glicosilado . Se cree que cuando el CI-MPR está presente en la superficie celular , el dominio 11 se unirá a cualquier IGF-II libre en la matriz extracelular . Luego, el receptor se internaliza rápidamente, junto con el IGF-II , a través de un motivo YSKV presente en la cola citoplasmática del CI-MPR. [13] Luego, el IGF-II se dirigirá al lisosoma donde se degradará. Esto regula el nivel de IGF-II libre en el cuerpo.
Esta función del CI-MPR se determinó mediante el uso de ratones knock-out . Se observó que los ratones deficientes en CI-MPR tenían un mayor nivel de IGF-II libre y órganos agrandados (alrededor de un 30% de aumento en tamaño [7] ). Estos ratones mueren el día 15 de gestación debido a hiperplasia cardíaca . [7] La muerte de los ratones podría prevenirse cuando también se eliminó el alelo de IGF-II . Cuando se eliminan el CI-MPR y el alelo de IGF-II, se observa un crecimiento normal del ratón ya que ya no hay un factor de crecimiento presente que necesite ser regulado.
Debido a la capacidad de CI-MPR para modular los niveles de IGF-II, se ha sugerido que puede desempeñar un papel como supresor de tumores . [13] Estudios de múltiples cánceres humanos han demostrado que una pérdida de la función de CI-MPR está asociada con una progresión en la tumorigénesis . [18] La pérdida de heterocigosidad (LOH) en el locus CI-MPR se ha mostrado en múltiples tipos de cáncer , incluidos el de hígado y el de mama . [13] [19] Sin embargo, este es un concepto relativamente nuevo y muchos más estudios tendrán que investigar la relación entre CI-MPR y el cáncer .