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Microscópio electrónico escaneando

La imagen de los granos de polen tomada con un SEM muestra la profundidad de campo característica de las micrografías SEM .
El primer SEM de M. von Ardenne
SEM con cámara de muestra abierta
SEM tipo analógico

Un microscopio electrónico de barrido ( SEM ) es un tipo de microscopio electrónico que produce imágenes de una muestra escaneando la superficie con un haz de electrones enfocado . Los electrones interactúan con los átomos de la muestra, produciendo diversas señales que contienen información sobre la topografía de la superficie y la composición de la muestra. El haz de electrones se escanea en un patrón de escaneo rasterizado y la posición del haz se combina con la intensidad de la señal detectada para producir una imagen. En el modo SEM más común, los electrones secundarios emitidos por átomos excitados por el haz de electrones se detectan utilizando un detector de electrones secundarios ( detector Everhart-Thornley ). El número de electrones secundarios detectables y, por tanto, la intensidad de la señal, depende, entre otras cosas, de la topografía de la muestra. Algunos SEM pueden alcanzar resoluciones mejores que 1 nanómetro.

Las muestras se observan en alto vacío en un SEM convencional, o en bajo vacío o en condiciones húmedas en un SEM de presión variable o ambiental, y en una amplia gama de temperaturas criogénicas o elevadas con instrumentos especializados. [1]

Historia

McMullan ha presentado un relato de la historia temprana de la microscopía electrónica de barrido. [2] [3] Aunque Max Knoll produjo una fotografía con un ancho de campo de objeto de 50 mm que muestra el contraste de canalización mediante el uso de un escáner de haz de electrones, [4] fue Manfred von Ardenne quien en 1937 inventó [5] un microscopio con alta resolución escaneando una trama muy pequeña con un haz de electrones desmagnificado y finamente enfocado. Ese mismo año, Cecil E. Hall también completó la construcción del primer microscopio de emisión en América del Norte, sólo dos años después de que su supervisor, EF Burton, en la Universidad de Toronto, se lo encargara. [6] Ardenne aplicó el escaneo del haz de electrones en un intento de superar la resolución del microscopio electrónico de transmisión (TEM), así como para mitigar problemas sustanciales con la aberración cromática inherente a las imágenes reales en el TEM. Además, analizó los diversos modos de detección, las posibilidades y la teoría del SEM, [7] junto con la construcción del primer SEM de alta resolución . [8] El grupo de Zworykin informó sobre trabajos adicionales , [9] seguido por los grupos de Cambridge en la década de 1950 y principios de la de 1960 [10] [11] [12] [13] encabezados por Charles Oatley , todo lo cual finalmente condujo a la comercialización del primer instrumento comercial de Cambridge Scientific Instrument Company como el "Stereoscan" en 1965, que fue entregado a DuPont .

Principios y capacidades

Fuente de electrones emisor Schottky
Volumen de interacción electrón-materia y tipos de señales generadas.

Las señales utilizadas por un SEM para producir una imagen resultan de las interacciones del haz de electrones con átomos a diversas profundidades dentro de la muestra. Se producen varios tipos de señales, incluidos electrones secundarios (SE), electrones reflejados o retrodispersados ​​(BSE), rayos X y luz característicos ( catodoluminiscencia ) (CL), corriente absorbida (corriente de muestra) y electrones transmitidos. Los detectores de electrones secundarios son equipo estándar en todos los SEM, pero es raro que una sola máquina tenga detectores para todas las demás señales posibles. [ cita necesaria ]

Los electrones secundarios tienen energías muy bajas del orden de 50 eV , lo que limita su recorrido libre medio en la materia sólida. En consecuencia, los SE solo pueden escapar de los pocos nanómetros superiores de la superficie de una muestra. La señal de los electrones secundarios tiende a estar altamente localizada en el punto de impacto del haz de electrones primario, lo que permite recolectar imágenes de la superficie de la muestra con una resolución inferior a 1 nm . Los electrones retrodispersados ​​(BSE) son haces de electrones que se reflejan en la muestra mediante dispersión elástica . Dado que tienen mucha más energía que los SE, emergen de ubicaciones más profundas dentro del espécimen y, en consecuencia, la resolución de las imágenes BSE es menor que la de las imágenes SE. Sin embargo, los BSE se utilizan a menudo en SEM analítico, junto con los espectros elaborados a partir de los rayos X característicos, porque la intensidad de la señal BSE está fuertemente relacionada con el número atómico (Z) de la muestra. Las imágenes de EEB pueden proporcionar información sobre la distribución, pero no la identidad, de diferentes elementos de la muestra. En muestras compuestas predominantemente de elementos ligeros, como muestras biológicas, las imágenes de EEB pueden obtener imágenes de inmunoetiquetas de oro coloidal de 5 o 10 nm de diámetro, que de otro modo serían difíciles o imposibles de detectar en imágenes de electrones secundarios. [14] Los rayos X característicos se emiten cuando el haz de electrones elimina un electrón de la capa interna de la muestra, lo que hace que un electrón de mayor energía llene la capa y libere energía. La energía o longitud de onda de estos rayos X característicos se puede medir mediante espectroscopia de rayos X de dispersión de energía o espectroscopia de rayos X de dispersión de longitud de onda y usarse para identificar y medir la abundancia de elementos en la muestra y mapear su distribución.

Debido al haz de electrones muy estrecho, las micrografías SEM tienen una gran profundidad de campo , lo que produce una apariencia tridimensional característica útil para comprender la estructura de la superficie de una muestra. [15] Esto se ejemplifica en la micrografía de polen que se muestra arriba. Es posible una amplia gama de aumentos, desde aproximadamente 10 veces (aproximadamente el equivalente al de una potente lente de mano) hasta más de 500.000 veces, aproximadamente 250 veces el límite de aumento de los mejores microscopios ópticos .

preparación de la muestra

Una araña recubierta de oro, preparada para ser observada con un SEM
Micrografía de bajo voltaje (300 V) de distribución de gotas de adhesivo en una nota Post-it . No se aplicó ningún recubrimiento conductor: dicho recubrimiento alteraría este frágil espécimen.

Las muestras SEM deben ser lo suficientemente pequeñas para caber en la platina de la muestra y pueden necesitar una preparación especial para aumentar su conductividad eléctrica y estabilizarlas, de modo que puedan soportar las condiciones de alto vacío y el haz de electrones de alta energía. Las muestras generalmente se montan rígidamente en un portamuestras o en un trozo utilizando un adhesivo conductor. SEM se utiliza ampliamente para el análisis de defectos de obleas semiconductoras y los fabricantes fabrican instrumentos que pueden examinar cualquier parte de una oblea semiconductora de 300 mm. Muchos instrumentos tienen cámaras que pueden inclinar un objeto de ese tamaño hasta 45° y proporcionar una rotación continua de 360°. [ cita necesaria ]

Las muestras no conductoras acumulan carga cuando son escaneadas por el haz de electrones, y especialmente en el modo de imagen de electrones secundarios, lo que provoca fallas de escaneo y otros artefactos en la imagen. Para obtener imágenes convencionales en el SEM, las muestras deben ser conductoras de electricidad , al menos en la superficie, y estar conectadas a tierra para evitar la acumulación de carga electrostática . Los objetos metálicos requieren poca preparación especial para SEM, excepto la limpieza y el montaje conductivo en un trozo de muestra. Los materiales no conductores generalmente se recubren con una capa ultrafina de material eléctricamente conductor, depositada sobre la muestra mediante recubrimiento por pulverización catódica de bajo vacío , deposición no electrolítica [ cita requerida ] o mediante evaporación de alto vacío. Los materiales conductores que se utilizan actualmente para el recubrimiento de muestras incluyen oro , aleaciones de oro/ paladio , platino , iridio , tungsteno , cromo , osmio , [14] y grafito . El recubrimiento con metales pesados ​​puede aumentar la relación señal/ruido en muestras de bajo número atómico (Z). La mejora surge porque se mejora la emisión de electrones secundarios para materiales con alto Z. [ cita necesaria ]

Una alternativa al recubrimiento para algunas muestras biológicas es aumentar la conductividad aparente del material mediante la impregnación con osmio utilizando variantes del método de tinción OTO ( tetróxido de osmio , T- tiocarbohidrazida , osmio ). [16] [17]

Se pueden obtener imágenes de muestras no conductoras sin recubrimiento utilizando un SEM ambiental (ESEM) o un modo de operación SEM de bajo voltaje. En los instrumentos ESEM, la muestra se coloca en una cámara de presión relativamente alta y la columna óptica de electrones se bombea diferencialmente para mantener el vacío adecuadamente [ se necesita aclaración ] bajo en el cañón de electrones. La región de alta presión alrededor de la muestra en el ESEM neutraliza la carga y proporciona una amplificación de la señal del electrón secundario. [ cita necesaria ] El SEM de bajo voltaje generalmente se realiza en un instrumento con cañones de emisión de campo (FEG) que son capaces de producir un alto brillo de electrones primarios y un tamaño de punto pequeño incluso con potenciales de aceleración bajos. Para evitar la carga de muestras no conductoras, las condiciones de operación deben ajustarse de modo que la corriente del haz entrante sea igual a la suma de las corrientes de electrones secundaria y retrodispersada salientes, una condición que se cumple con mayor frecuencia con voltajes de aceleración de 0,3 a 4 kV. [ cita necesaria ]

La incrustación en una resina con un pulido adicional hasta obtener un acabado similar a un espejo se puede utilizar para muestras tanto biológicas como de materiales cuando se obtienen imágenes en electrones retrodispersados ​​o cuando se realizan microanálisis cuantitativos de rayos X.

Las principales técnicas de preparación no son necesarias en el SEM ambiental que se describe a continuación, pero algunas muestras biológicas pueden beneficiarse de la fijación.

Muestras biológicas

Convencionalmente, se requiere que una muestra SEM esté completamente seca, ya que la cámara de la muestra está bajo alto vacío. Los materiales duros y secos como madera, huesos, plumas, insectos secos o cáscaras (incluidas las cáscaras de huevo [18] ) pueden examinarse con poco tratamiento adicional, pero las células y tejidos vivos y los organismos enteros de cuerpo blando requieren fijación química para preservarlos. y estabilizar su estructura.

La fijación generalmente se realiza mediante incubación en una solución de un fijador químico tamponado , como glutaraldehído , a veces en combinación con formaldehído [19] [20] [21] y otros fijadores, [22] y, opcionalmente, seguida de una fijación posterior con tetróxido de osmio. [19] A continuación, el tejido fijado se deshidrata. Debido a que el secado al aire causa colapso y contracción, esto comúnmente se logra reemplazando el agua en las celdas con solventes orgánicos como etanol o acetona , y reemplazando estos solventes a su vez con un fluido de transición como dióxido de carbono líquido mediante secado en punto crítico . [23] El dióxido de carbono finalmente se elimina mientras se encuentra en un estado supercrítico, de modo que no haya una interfaz gas-líquido dentro de la muestra durante el secado.

La muestra seca generalmente se monta en un trozo de muestra usando un adhesivo como resina epoxi o cinta adhesiva de doble cara eléctricamente conductora, y se recubre con oro o una aleación de oro/paladio antes de examinarla en el microscopio. Las muestras se pueden seccionar (con un micrótomo ) si se va a exponer información sobre la ultraestructura interna del organismo para obtener imágenes.

Si el SEM está equipado con una etapa fría para criomicroscopía, se puede utilizar criofijación y realizar microscopía electrónica de barrido a baja temperatura en las muestras fijadas criogénicamente. [19] Las muestras criofijadas pueden criofracturarse al vacío en un aparato especial para revelar la estructura interna, recubrirse por pulverización catódica y transferirse a la crioetapa SEM mientras aún están congeladas. [24] La microscopía electrónica de barrido de baja temperatura (LT-SEM) también es aplicable a la obtención de imágenes de materiales sensibles a la temperatura como el hielo [25] [26] y las grasas. [27]

La liofilización, el grabado por congelación o la congelación y rotura es un método de preparación particularmente útil para examinar las membranas lipídicas y sus proteínas incorporadas en vista "de frente". El método de preparación revela las proteínas incrustadas en la bicapa lipídica.

Materiales

Las imágenes de electrones retrodispersados, el análisis cuantitativo de rayos X y el mapeo de muestras por rayos X a menudo requieren esmerilar y pulir las superficies hasta obtener una superficie ultralisa. Las muestras que se someten a análisis WDS o EDS suelen estar recubiertas de carbono. En general, los metales no se recubren antes de la obtención de imágenes en el SEM porque son conductores y proporcionan su propio camino a tierra. La fractografía es el estudio de superficies fracturadas que se puede realizar con un microscopio óptico o, comúnmente, con un SEM. La superficie fracturada se corta a un tamaño adecuado, se limpia de residuos orgánicos y se monta en un portamuestras para su visualización en el SEM. Los circuitos integrados se pueden cortar con un haz de iones enfocado (FIB) u otro instrumento de fresado de haz de iones para verlos en el SEM. El SEM en el primer caso puede incorporarse al FIB, permitiendo obtener imágenes de alta resolución del resultado del proceso. Los metales, las muestras geológicas y los circuitos integrados también pueden pulirse químicamente para su visualización en el SEM. Se requieren técnicas especiales de recubrimiento de alta resolución para obtener imágenes con gran aumento de películas delgadas inorgánicas.

Proceso de escaneo y formación de imágenes.

Esquema de un SEM

En un SEM típico, se emite termoiónicamente un haz de electrones desde un cañón de electrones equipado con un cátodo de filamento de tungsteno . El tungsteno se utiliza normalmente en cañones de electrones termoiónicos porque tiene el punto de fusión más alto y la presión de vapor más baja de todos los metales, lo que permite calentarlo eléctricamente para emitir electrones, y debido a su bajo costo. Otros tipos de emisores de electrones incluyen el hexaboruro de lantano ( LaB
6) cátodos, que pueden utilizarse en un SEM de filamento de tungsteno estándar si se actualiza el sistema de vacío, o pistolas de emisión de campo (FEG), que pueden ser del tipo de cátodo frío que utilizan emisores monocristalinos de tungsteno o del tipo Schottky asistido térmicamente , que Utilice emisores de monocristales de tungsteno recubiertos de óxido de circonio .

El haz de electrones, que normalmente tiene una energía que oscila entre 0,2 keV y 40 keV, se enfoca mediante una o dos lentes de condensador en un punto de aproximadamente 0,4 nm a 5 nm de diámetro. El haz pasa a través de pares de bobinas de escaneo o pares de placas deflectoras en la columna de electrones, típicamente en la lente final, que desvían el haz en los ejes x e y de modo que escanea en forma de trama sobre un área rectangular de la superficie de la muestra. .

Mecanismos de emisión de electrones secundarios, electrones retrodispersados ​​y rayos X característicos de los átomos de la muestra.

Cuando el haz de electrones primario interactúa con la muestra, los electrones pierden energía mediante dispersión y absorción aleatorias repetidas dentro de un volumen en forma de lágrima de la muestra conocido como volumen de interacción , que se extiende desde menos de 100 nm hasta aproximadamente 5 µm en la superficie. El tamaño del volumen de interacción depende de la energía de aterrizaje del electrón, el número atómico de la muestra y la densidad de la muestra. El intercambio de energía entre el haz de electrones y la muestra da como resultado la reflexión de electrones de alta energía por dispersión elástica, la emisión de electrones secundarios por dispersión inelástica y la emisión de radiación electromagnética , cada una de las cuales puede ser detectada por detectores especializados. La corriente del haz absorbida por la muestra también se puede detectar y utilizar para crear imágenes de la distribución de la corriente de la muestra. Se utilizan amplificadores electrónicos de varios tipos para amplificar las señales, que se muestran como variaciones de brillo en un monitor de computadora (o, en los modelos antiguos, en un tubo de rayos catódicos ). Cada píxel de la memoria de vídeo de la computadora está sincronizado con la posición del haz sobre la muestra en el microscopio y, por lo tanto, la imagen resultante es un mapa de distribución de la intensidad de la señal que se emite desde el área escaneada de la muestra. Los microscopios más antiguos capturaban imágenes en película, pero la mayoría de los instrumentos modernos recopilan imágenes digitales .

Serie de aumentos SEM a baja temperatura para un cristal de nieve . Los cristales se capturan, almacenan y se recubren con platino a temperaturas criogénicas para obtener imágenes.

Aumento

La ampliación en un SEM se puede controlar en un rango de aproximadamente 6 órdenes de magnitud, desde aproximadamente 10 a 3.000.000 de veces. [28] A diferencia de los microscopios ópticos y electrónicos de transmisión, la ampliación de la imagen en un SEM no es función de la potencia de la lente del objetivo . Los SEM pueden tener lentes condensadoras y objetivas, pero su función es enfocar el haz en un punto y no tomar imágenes de la muestra. Siempre que el cañón de electrones pueda generar un haz con un diámetro suficientemente pequeño, un SEM podría funcionar en principio sin condensador ni lentes objetivo. Sin embargo, puede que no sea muy versátil ni alcance una resolución muy alta. En un SEM, como en la microscopía de sonda de barrido , la ampliación resulta de la relación entre la trama en el dispositivo de visualización y las dimensiones de la trama en la muestra. Suponiendo que la pantalla de visualización tiene un tamaño fijo, se obtiene una mayor ampliación al reducir el tamaño de la trama en la muestra, y viceversa. Por lo tanto, la ampliación se controla mediante la corriente suministrada a las bobinas de exploración x, y, o el voltaje suministrado a las placas deflectoras x, y, y no mediante la potencia de la lente del objetivo.

Detección de electrones secundarios.

El modo de imagen más común recolecta electrones secundarios de baja energía (<50 eV) que son expulsados ​​de las bandas de conducción o de valencia de los átomos de la muestra mediante interacciones de dispersión inelástica con los electrones del haz. Debido a su baja energía, estos electrones se originan a unos pocos nanómetros por debajo de la superficie de la muestra. [15] Los electrones son detectados por un detector Everhart-Thornley , [29] que es un tipo de sistema colector- centelleador - fotomultiplicador . Los electrones secundarios se recogen primero atrayéndolos hacia una rejilla polarizada eléctricamente a aproximadamente +400 V, y luego se aceleran aún más hacia un fósforo o centelleador polarizado positivamente a aproximadamente +2000 V. Los electrones secundarios acelerados ahora tienen suficiente energía para hacer que el centelleador emiten destellos de luz (catodoluminiscencia), que se conducen a un fotomultiplicador fuera de la columna SEM a través de un tubo de luz y una ventana en la pared de la cámara de muestras. La señal eléctrica amplificada emitida por el fotomultiplicador se muestra como una distribución de intensidad bidimensional que puede verse y fotografiarse en una pantalla de vídeo analógica , o someterse a una conversión de analógico a digital y visualizarse y guardarse como una imagen digital . Este proceso se basa en un haz primario escaneado por trama. El brillo de la señal depende del número de electrones secundarios que llegan al detector . Si el haz entra en la muestra perpendicular a la superficie, entonces la región activada es uniforme alrededor del eje del haz y un cierto número de electrones "escapan" del interior de la muestra. A medida que aumenta el ángulo de incidencia, aumenta el volumen de interacción y disminuye la distancia de "escape" de un lado del haz, lo que da como resultado que la muestra emita más electrones secundarios. Por lo tanto, las superficies y los bordes empinados tienden a ser más brillantes que las superficies planas, lo que da como resultado imágenes con una apariencia tridimensional bien definida. Utilizando la señal de electrones secundarios es posible una resolución de imagen inferior a 0,5 nm.

Detección de electrones retrodispersados.

Comparación de técnicas SEM:
Arriba: análisis de electrones retrodispersados ​​– composición
Abajo: análisis de electrones secundarios – topografía

Los electrones retrodispersados ​​(BSE) consisten en electrones de alta energía que se originan en el haz de electrones y que se reflejan o retrodispersan fuera del volumen de interacción de la muestra mediante interacciones de dispersión elástica con los átomos de la muestra. Dado que los elementos pesados ​​(número atómico alto) retrodispersan los electrones con más fuerza que los elementos ligeros (número atómico bajo) y, por lo tanto, aparecen más brillantes en la imagen, los BSE se utilizan para detectar el contraste entre áreas con diferentes composiciones químicas. [15] El detector Everhart-Thornley, que normalmente se coloca a un lado de la muestra, es ineficaz para la detección de electrones retrodispersados ​​porque se emiten pocos electrones en el ángulo sólido subtendido por el detector y porque la rejilla de detección con polarización positiva tiene poca capacidad para atraer la EEB de mayor energía. Los detectores de electrones retrodispersados ​​dedicados se colocan encima de la muestra en una disposición tipo "rosquilla", concéntrica con el haz de electrones, maximizando el ángulo sólido de recolección. Los detectores de EEB suelen ser del tipo centelleador o semiconductor. Cuando todas las partes del detector se utilizan para recolectar electrones simétricamente alrededor del haz, se produce un contraste de números atómicos. Sin embargo, se produce un fuerte contraste topográfico al recolectar electrones retrodispersados ​​desde un lado por encima de la muestra utilizando un detector BSE direccional asimétrico; el contraste resultante aparece como iluminación de la topografía desde ese lado. Los detectores semiconductores se pueden fabricar en segmentos radiales que se pueden activar o desactivar para controlar el tipo de contraste producido y su direccionalidad.

Los electrones retrodispersados ​​también se pueden utilizar para formar una imagen de difracción de retrodispersión de electrones (EBSD) que se puede utilizar para determinar la estructura cristalográfica de la muestra.

Análisis de inyección de haz de semiconductores.

La naturaleza de la sonda del SEM, electrones energéticos, la hace especialmente adecuada para examinar las propiedades ópticas y electrónicas de los materiales semiconductores. Los electrones de alta energía del haz SEM inyectarán portadores de carga en el semiconductor. Así, los electrones del haz pierden energía al promover electrones de la banda de valencia a la banda de conducción , dejando atrás huecos .

En un material de banda prohibida directa , la recombinación de estos pares de huecos de electrones dará como resultado catodoluminiscencia; Si la muestra contiene un campo eléctrico interno, como el que está presente en una unión pn , la inyección de portadores en el haz SEM hará que fluya la corriente inducida por haz de electrones (EBIC). La catodoluminiscencia y la EBIC se denominan técnicas de "inyección de haz" y son sondas muy potentes del comportamiento optoelectrónico de los semiconductores, en particular para estudiar características y defectos a nanoescala.

catodoluminiscencia

Superposición de catodoluminiscencia en color sobre una imagen SEM de un policristal de InGaN . Los canales azul y verde representan colores reales, el canal rojo corresponde a la emisión UV.

La catodoluminiscencia , la emisión de luz cuando los átomos excitados por electrones de alta energía regresan a su estado fundamental, es análoga a la fluorescencia inducida por rayos UV , y algunos materiales como el sulfuro de zinc y algunos tintes fluorescentes exhiben ambos fenómenos. En las últimas décadas, la catodoluminiscencia se experimentó más comúnmente como la emisión de luz desde la superficie interna del tubo de rayos catódicos en televisores y monitores CRT de computadora. En el SEM, los detectores CL recogen toda la luz emitida por la muestra o pueden analizar las longitudes de onda emitidas por la muestra y mostrar un espectro de emisión o una imagen de la distribución de catodoluminiscencia emitida por la muestra en color real.

microanálisis de rayos X

Los rayos X característicos que se producen por la interacción de electrones con la muestra también se pueden detectar en un SEM equipado para espectroscopia de rayos X de energía dispersiva o espectroscopia de rayos X de longitud de onda dispersiva . Se puede utilizar el análisis de las señales de rayos X para mapear la distribución y estimar la abundancia de elementos en la muestra.

Resolución del SEM

Un vídeo que ilustra un rango de aumento práctico típico de un microscopio electrónico de barrido diseñado para muestras biológicas. El vídeo comienza en 25×, aproximadamente 6 mm en todo el campo de visión, y se acerca a 12000×, aproximadamente 12  μm en todo el campo de visión. Los objetos esféricos son perlas de vidrio con un diámetro de 10 μm, similar en diámetro a un glóbulo rojo .

SEM no es una cámara y el detector no forma imágenes continuamente como una matriz CCD o una película . A diferencia de un sistema óptico, la resolución no está limitada por el límite de difracción , la finura de las lentes o espejos o la resolución del conjunto de detectores. La óptica de enfoque puede ser grande y tosca, y el detector SE tiene el tamaño de un puño y detecta simplemente la corriente. En cambio, la resolución espacial del SEM depende del tamaño del punto del electrón, que a su vez depende tanto de la longitud de onda de los electrones como del sistema óptico-electrónico que produce el haz de escaneo. La resolución también está limitada por el tamaño del volumen de interacción, el volumen de material de muestra que interactúa con el haz de electrones. El tamaño del punto y el volumen de interacción son grandes en comparación con las distancias entre los átomos, por lo que la resolución del SEM no es lo suficientemente alta para obtener imágenes de átomos individuales, como es posible con un microscopio electrónico de transmisión (TEM). Sin embargo, el SEM tiene ventajas compensatorias, incluida la capacidad de obtener imágenes de un área comparativamente grande de la muestra; la capacidad de visualizar materiales a granel (no sólo películas o láminas delgadas); y la variedad de modos analíticos disponibles para medir la composición y propiedades de la muestra. Dependiendo del instrumento, la resolución puede oscilar entre menos de 1 nm y 20 nm. A partir de 2009, el SEM convencional de mayor resolución del mundo (≤30 kV) puede alcanzar una resolución puntual de 0,4 nm utilizando un detector de electrones secundario. [30]

SEM ambiental

El SEM convencional requiere que se tomen imágenes de las muestras al vacío , porque una atmósfera de gas se propaga rápidamente y atenúa los haces de electrones. Como consecuencia, las muestras que producen una cantidad significativa de vapor , por ejemplo, muestras biológicas húmedas o rocas que contienen petróleo, deben secarse o congelarse criogénicamente. Los procesos que implican transiciones de fase , como el secado de adhesivos o la fusión de aleaciones , el transporte de líquidos, reacciones químicas y sistemas sólido-aire-gas, en general no se pueden observar con el SEM convencional de alto vacío. En SEM ambiental (ESEM), se evacua el aire de la cámara, pero el vapor de agua se retiene cerca de su presión de saturación y la presión residual permanece relativamente alta. Esto permite el análisis de muestras que contienen agua u otras sustancias volátiles. Con ESEM ha sido posible observar insectos vivos. [31]

El primer desarrollo comercial del ESEM a finales de la década de 1980 [32] [33] permitió observar muestras en entornos gaseosos de baja presión (por ejemplo, 1–50 Torr o 0,1–6,7 kPa) y alta humedad relativa (hasta 100%). . Esto fue posible gracias al desarrollo de un detector de electrones secundarios [34] [35] capaz de funcionar en presencia de vapor de agua y mediante el uso de aberturas limitadoras de presión con bombeo diferencial en la trayectoria del haz de electrones para separar los región de vacío (alrededor de la pistola y las lentes) de la cámara de muestra. Los primeros ESEM comerciales fueron producidos por ElectroScan Corporation en EE. UU. en 1988. ElectroScan fue adquirida por Philips (que luego vendió su división de electrónica y óptica a FEI Company) en 1996. [36]

ESEM es especialmente útil para materiales biológicos y no metálicos porque no es necesario recubrirlos con carbono u oro. Los plásticos y elastómeros sin recubrimiento se pueden examinar de forma rutinaria, al igual que las muestras biológicas sin recubrimiento. Esto es útil porque el recubrimiento puede ser difícil de revertir, puede ocultar pequeñas características en la superficie de la muestra y puede reducir el valor de los resultados obtenidos. El análisis de rayos X es difícil con un recubrimiento de un metal pesado, por lo que los recubrimientos de carbono se utilizan habitualmente en los SEM convencionales, pero ESEM permite realizar microanálisis de rayos X en muestras no conductoras sin recubrimiento; sin embargo, en el análisis de rayos X se introducen algunos artefactos específicos de ESEM. ESEM puede ser el preferido para la microscopía electrónica de muestras únicas de acciones penales o civiles, donde es posible que varios expertos diferentes deban repetir el análisis forense . Es posible estudiar muestras en líquido con ESEM o con otros métodos de microscopía electrónica en fase líquida . [37]

Transmisión SEM

El SEM también se puede utilizar en modo de transmisión simplemente incorporando un detector apropiado debajo de una sección delgada de la muestra. [38] Hay detectores disponibles para campo brillante, campo oscuro, así como detectores segmentados para campo oscuro anular de ángulo medio a alto . A pesar de la diferencia en la instrumentación, esta técnica todavía se conoce comúnmente como microscopía electrónica de transmisión de barrido (STEM) .

SEM en Ciencias Forenses

El SEM se utiliza a menudo en ciencias forenses para análisis ampliados de objetos microscópicos como diatomeas y residuos de disparos . Debido a que SEM es una fuerza no destructiva sobre la muestra, se puede utilizar para analizar evidencia sin dañarla. El SEM dispara un haz de electrones de alta energía a la muestra que rebota en la muestra sin cambiarla ni destruirla. Esto es genial cuando se trata de analizar diatomeas. Cuando una persona muere ahogada, inhala el agua, lo que hace que lo que contiene (diatomeas) llegue al torrente sanguíneo, al cerebro, a los riñones y más. Estas diatomeas en el cuerpo se pueden ampliar con el SEM para determinar el tipo de diatomeas, lo que ayuda a comprender cómo y dónde murió la persona. Al utilizar las imágenes producidas por el SEM, los científicos forenses pueden comparar los tipos de diatomeas para confirmar la masa de agua en la que murió una persona. [39]

El análisis de residuos de munición (GSR) se puede realizar con muchos instrumentos analíticos diferentes, [40] pero SEM es una forma común de analizar compuestos inorgánicos debido a la forma en que puede analizar de cerca los tipos de elementos (principalmente metales) a través de sus tres detectores: retrodispersión. detector de electrones, detector de electrones secundario y detector de rayos X. El GSR se puede recopilar de la escena del crimen, de la víctima o del tirador y analizarse con el SEM. Esto puede ayudar a los científicos a determinar la proximidad o el contacto con el arma de fuego disparada. [40]

Color en MEB

Los microscopios electrónicos no producen imágenes en color de forma natural, ya que un SEM produce un único valor por píxel ; este valor corresponde al número de electrones recibidos por el detector durante un pequeño período de tiempo del escaneo cuando el haz se dirige a la posición de píxel (x, y).

Este único número suele estar representado, para cada píxel, por un nivel de gris, formando una imagen monocromática. [41] Sin embargo, se han utilizado varias formas de obtener imágenes de microscopía electrónica en color. [42]

Falso color usando un solo detector

La forma más sencilla de obtener color es asociar a este único número un color arbitrario, utilizando una tabla de búsqueda de colores (es decir, cada nivel de gris se reemplaza por un color elegido). Este método se conoce como color falso . En una imagen BSE, se puede realizar un color falso para distinguir mejor las distintas fases de la muestra. [43]

Como alternativa a simplemente reemplazar cada nivel de gris por un color, una muestra observada por un haz oblicuo permite a los investigadores crear una imagen topográfica aproximada (consulte la sección "Representación fotométrica 3D a partir de una única imagen SEM"). Luego, dicha topografía se puede procesar mediante algoritmos de renderizado 3D para una representación más natural de la textura de la superficie.

Coloración de imágenes SEM

Muy a menudo, las imágenes SEM publicadas están coloreadas artificialmente. [43] Esto se puede hacer por un efecto estético, para aclarar la estructura o para agregar una apariencia realista a la muestra y generalmente no agrega información sobre la muestra. [44]

La coloración se puede realizar manualmente con software de edición de fotografías o semiautomáticamente con software dedicado que utiliza detección de características o segmentación orientada a objetos. [45]

Color creado utilizando múltiples detectores de electrones.

En algunas configuraciones se recopila más información por píxel, a menudo mediante el uso de múltiples detectores. [46]

Como ejemplo común, se superponen detectores de electrones secundarios y de electrones retrodispersados ​​y se asigna un color a cada una de las imágenes capturadas por cada detector, [47] [48] con el resultado de una imagen en color combinada donde los colores están relacionados con la densidad de los componentes. Este método se conoce como SEM de color dependiente de la densidad (DDC-SEM). Las micrografías producidas por DDC-SEM retienen información topográfica, que es mejor capturada por el detector de electrones secundarios y la combinan con la información sobre densidad, obtenida por el detector de electrones retrodispersados. [49] [50]

Señales analíticas basadas en fotones generados.

La medición de la energía de los fotones emitidos por la muestra es un método común para obtener capacidades analíticas. Algunos ejemplos son los detectores de espectroscopía de rayos X de dispersión de energía (EDS) utilizados en el análisis elemental y los sistemas de microscopio de catodoluminiscencia (CL) que analizan la intensidad y el espectro de la luminiscencia inducida por electrones en (por ejemplo) muestras geológicas. En los sistemas SEM que utilizan estos detectores, es común codificar con colores estas señales adicionales y superponerlas en una imagen de un solo color, de modo que las diferencias en la distribución de los diversos componentes de la muestra se puedan ver claramente y comparar. Opcionalmente, la imagen de electrones secundarios estándar se puede fusionar con uno o más canales de composición, de modo que se pueda comparar la estructura y composición de la muestra. Estas imágenes se pueden crear manteniendo la integridad total de los datos de la señal original, que no se modifican de ninguna manera.

3D en SEM

Los SEM no proporcionan imágenes 3D de forma natural, a diferencia de los SPM . Sin embargo, los datos 3D se pueden obtener utilizando un SEM con diferentes métodos como se muestra a continuación.

Reconstrucción SEM 3D a partir de un par estéreo

Reconstrucción fotométrica SEM 3D a partir de un detector de cuatro cuadrantes mediante "forma a partir de sombreado"

Este método suele utilizar un detector BSE de cuatro cuadrantes (alternativamente, para un fabricante, un detector de 3 segmentos). El microscopio produce cuatro imágenes de la misma muestra al mismo tiempo, por lo que no es necesario inclinar la muestra. El método proporciona dimensiones metrológicas en 3D siempre que la pendiente de la muestra sea razonable. [43] La mayoría de los fabricantes de SEM ahora (2018) ofrecen un detector de EEB de cuatro cuadrantes incorporado u opcional, junto con un software propietario para calcular una imagen 3D en tiempo real. [52]

Otros enfoques utilizan métodos más sofisticados (y a veces intensivos en GPU), como el algoritmo de estimación óptima , y ​​ofrecen resultados mucho mejores [53] a costa de altas demandas de potencia informática.

En todos los casos, este enfoque funciona mediante la integración de la pendiente, por lo que se ignoran las pendientes verticales y los voladizos; por ejemplo, si una esfera entera se encuentra sobre un plano, se ve poco más que el hemisferio superior emergiendo sobre el plano, lo que resulta en una altitud incorrecta del vértice de la esfera. La importancia de este efecto depende del ángulo de los detectores BSE con respecto a la muestra, pero estos detectores suelen estar situados alrededor (y cerca de) el haz de electrones, por lo que este efecto es muy común.

Representación fotométrica 3D a partir de una única imagen SEM

Este método requiere una imagen SEM obtenida con iluminación oblicua de ángulo bajo. Luego, el nivel de grises se interpreta como la pendiente, y la pendiente se integra para restaurar la topografía del espécimen. Este método es interesante para la mejora visual y la detección de la forma y posición de objetos; sin embargo, las alturas verticales normalmente no se pueden calibrar, a diferencia de otros métodos como la fotogrametría. [43]

Otros tipos de reconstrucción SEM 3D

Aplicaciones del SEM 3D

Una posible aplicación es medir la rugosidad de los cristales de hielo. Este método puede combinar SEM ambiental de presión variable y las capacidades 3D del SEM para medir la rugosidad en facetas individuales de cristales de hielo, convertirlo en un modelo de computadora y ejecutar análisis estadísticos adicionales en el modelo. [61] Otras mediciones incluyen la dimensión fractal, el examen de la superficie de fractura de los metales, la caracterización de materiales, la medición de la corrosión y las mediciones dimensionales a escala nanométrica (altura del escalón, volumen, ángulo, planitud, relación de soporte, coplanaridad, etc.). [ cita necesaria ]

Los conservacionistas del arte también utilizan SEM para discernir amenazas a la estabilidad de la superficie de las pinturas debido al envejecimiento, como la formación de complejos de iones de zinc con ácidos grasos . [62] Los científicos forenses utilizan SEM para detectar falsificaciones de arte .

Galería de imágenes SEM

Los siguientes son ejemplos de imágenes tomadas con un SEM.

Ver también

Referencias

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