El marcaje con inmunooro o tinción con inmunooro ( IGS ) es una técnica de tinción utilizada en microscopía electrónica . [2] Esta técnica de tinción es equivalente a la técnica de inmunofluorescencia indirecta para luz visible. Las partículas de oro coloidal suelen estar unidas a anticuerpos secundarios que, a su vez, están unidos a anticuerpos primarios diseñados para unirse a un antígeno específico u otro componente celular . El oro se utiliza por su alta densidad electrónica , que aumenta la dispersión de electrones para producir "puntos oscuros" de alto contraste. [3]
Utilizado por primera vez en 1971, el marcaje con inmunooro se ha aplicado tanto a la microscopía electrónica de transmisión como a la microscopía electrónica de barrido , así como a la microscopía de campo claro . La técnica de etiquetado se puede adaptar para distinguir múltiples objetos mediante el uso de partículas de oro de diferentes tamaños.
El etiquetado con inmunooro puede introducir artefactos, ya que las partículas de oro residen a cierta distancia del objeto etiquetado y se requiere un corte muy fino durante la preparación de la muestra. [3]
El etiquetado con inmunogold fue utilizado por primera vez en 1971 por Faulk y Taylor para identificar antígenos de Salmonella . [2] [4] Se aplicó por primera vez en microscopía electrónica de transmisión (TEM) y fue especialmente útil para resaltar proteínas que se encuentran en bajas densidades, como algunos antígenos de la superficie celular. [5] A medida que aumentó la resolución de la microscopía electrónica de barrido (SEM), también aumentó la necesidad de etiquetas del tamaño de nanopartículas, como el inmunooro. En 1975, Horisberger y sus colaboradores visualizaron con éxito nanopartículas de oro con un diámetro inferior a 30 nm [6] y pronto se convirtió en una técnica SEM establecida. [5]
Primero, se corta una sección delgada de la muestra, a menudo utilizando un microtomo . [7] Luego pueden tener lugar otras etapas de preparación de la muestra .
Luego, la muestra preparada se incuba con un anticuerpo específico diseñado para unirse a la molécula de interés. [3] A continuación, se agrega un anticuerpo secundario que tiene partículas de oro adheridas y se une al anticuerpo primario. El oro también se puede unir a la proteína A o a la proteína G en lugar de a un anticuerpo secundario, ya que estas proteínas se unen a regiones Fc de IgG de mamíferos de forma no específica. [6]
La partícula de oro densa en electrones ahora se puede ver bajo un microscopio electrónico como un punto negro, que marca indirectamente la molécula de interés. [3]
El etiquetado con inmunogold se puede utilizar para visualizar más de un objetivo simultáneamente. Esto se puede lograr en microscopía electrónica utilizando dos partículas de oro de diferentes tamaños. [8] Una extensión de este método utilizó tres partículas de oro de diferentes tamaños para rastrear la localización de los péptidos reguladores . [9] Un método más complejo de etiquetado de sitios múltiples implica marcar los lados opuestos de un sitio antigénico por separado; las partículas de inmunooro adheridas a ambos lados se pueden ver simultáneamente. [10]
Aunque el marcaje con inmunooro se utiliza normalmente para la microscopía electrónica de transmisión, cuando el oro está "mejorado con plata" se puede ver mediante microscopía de campo claro . [11] La mejora de la plata aumenta el tamaño de las partículas, lo que también hace posible la microscopía electrónica de barrido. Para producir partículas de oro mejoradas con plata, se colocan partículas de oro coloidal en una solución ácida potenciadora que contiene iones de plata . Luego, las partículas de oro actúan como un sitio de nucleación y la plata se deposita sobre la partícula. Un ejemplo de la aplicación del marcaje con inmunooro mejorado con plata (IGSS) fue la identificación del patógeno Erwinia amylovora . [11]
Una limitación inherente a la técnica de inmunooro es que la partícula de oro está a una distancia de entre 15 y 30 nm del sitio al que está unido el anticuerpo primario [5] (cuando se utiliza una estrategia de etiquetado de anticuerpos primarios y secundarios ). Por lo tanto, no se puede calcular con precisión la ubicación exacta de la molécula objetivo. Se pueden crear partículas de oro con un diámetro de 1 nm (o menos), pero luego se presenta otra limitación: en estos tamaños, la etiqueta de oro resulta difícil de distinguir de la estructura del tejido. [2] [5]
Se requieren secciones delgadas para el etiquetado con inmunooro y éstas pueden producir imágenes engañosas; Es posible que una fina porción de un componente celular no proporcione una visión precisa de su estructura tridimensional . Por ejemplo, un microtúbulo puede aparecer como un "pico" según el plano en el que se produjo la sección. Para superar esta limitación, se pueden tomar secciones en serie, que luego se pueden compilar en una imagen tridimensional . [3]
Una limitación adicional es que los anticuerpos y las partículas de oro no pueden penetrar la resina utilizada para incrustar muestras para obtener imágenes. Por lo tanto, sólo se pueden seleccionar y visualizar moléculas accesibles. El etiquetado antes de incorporar la muestra puede reducir el impacto negativo de esta limitación. [3]