Una tríada catalítica es un conjunto de tres aminoácidos coordinados que se pueden encontrar en el sitio activo de algunas enzimas . [1] [2] Las tríadas catalíticas se encuentran más comúnmente en las enzimas hidrolasa y transferasa (por ejemplo, proteasas , amidasas , esterasas , acilasas , lipasas y β-lactamasas ). Una tríada ácido - base - nucleófilo es un motivo común para generar un residuo nucleofílico para la catálisis covalente . Los residuos forman una red de relevo de carga para polarizar y activar el nucleófilo, que ataca al sustrato , formando un intermedio covalente que luego se hidroliza para liberar el producto y regenerar la enzima libre. El nucleófilo es más comúnmente un aminoácido serina o cisteína , pero ocasionalmente treonina o incluso selenocisteína . La estructura 3D de la enzima reúne los residuos de la tríada en una orientación precisa, aunque puedan estar muy separados en la secuencia ( estructura primaria ). [3]
Además de la evolución divergente de la función (e incluso del nucleófilo de la tríada), las tríadas catalíticas muestran algunos de los mejores ejemplos de evolución convergente . Las restricciones químicas sobre la catálisis han llevado a que la misma solución catalítica evolucione de forma independiente en al menos 23 superfamilias distintas . [2] Su mecanismo de acción es, en consecuencia, uno de los mejor estudiados en bioquímica . [4] [5]
Las enzimas tripsina y quimotripsina se purificaron por primera vez en la década de 1930. [6] Una serina en cada una de las enzimas tripsina y quimotripsina fue identificada como el nucleófilo catalítico (por modificación con fluorofosfato de diisopropilo ) en la década de 1950. [7] La estructura de la quimotripsina fue resuelta por cristalografía de rayos X en la década de 1960, mostrando la orientación de la tríada catalítica en el sitio activo . [8] Otras proteasas fueron secuenciadas y alineadas para revelar una familia de proteasas relacionadas, [9] [10] [11] ahora llamada la familia S1. Simultáneamente, se encontró que las estructuras de las proteasas papaína y subtilisina evolutivamente no relacionadas contenían tríadas análogas. El mecanismo de "relé de carga" para la activación del nucleófilo por los otros miembros de la tríada fue propuesto a fines de la década de 1960. [12] A medida que se resolvieron más estructuras de proteasas mediante cristalografía de rayos X en los años 1970 y 1980, se encontraron tríadas homólogas (como la proteasa TEV ) y análogas (como la papaína). [13] [14] [15] El sistema de clasificación MEROPS en los años 1990 y 2000 comenzó a clasificar las proteasas en superfamilias de enzimas estructuralmente relacionadas y, por lo tanto, actúa como una base de datos de la evolución convergente de tríadas en más de 20 superfamilias. [16] [17] La comprensión de cómo las restricciones químicas en la evolución llevaron a la convergencia de tantas familias de enzimas en las mismas geometrías de tríada se ha desarrollado en la década de 2010. [2]
Desde su descubrimiento inicial, se han realizado investigaciones cada vez más detalladas sobre su mecanismo catalítico exacto. En los años 1990 y 2000, hubo una controversia particular sobre si los enlaces de hidrógeno de baja barrera contribuían a la catálisis [18] [19] [20] o si los enlaces de hidrógeno ordinarios eran suficientes para explicar el mecanismo [21] [22] . La enorme cantidad de trabajos sobre la catálisis covalente por relé de carga que utilizan las tríadas catalíticas ha hecho que el mecanismo sea el mejor caracterizado en toda la bioquímica [4] [5] [21]
Las enzimas que contienen una tríada catalítica la utilizan para uno de dos tipos de reacciones: ya sea para dividir un sustrato ( hidrolasas ) o para transferir una porción de un sustrato a un segundo sustrato ( transferasas ). Las tríadas son un conjunto interdependiente de residuos en el sitio activo de una enzima y actúan en conjunto con otros residuos (por ejemplo, sitio de unión y agujero de oxianión ) para lograr la catálisis nucleofílica . Estos residuos de la tríada actúan juntos para hacer que el miembro nucleófilo sea altamente reactivo , generando un intermedio covalente con el sustrato que luego se resuelve para completar la catálisis. [23]
Las tríadas catalíticas realizan catálisis covalente utilizando un residuo como nucleófilo. La reactividad del residuo nucleófilo aumenta con los grupos funcionales de los otros miembros de la tríada. El nucleófilo está polarizado y orientado por la base, que a su vez está unida y estabilizada por el ácido. [24]
La catálisis se realiza en dos etapas. En primer lugar, el nucleófilo activado ataca al carbono carbonílico y obliga al oxígeno carbonílico a aceptar un par de electrones, lo que da lugar a un intermedio tetraédrico . La acumulación de carga negativa en este intermedio se estabiliza normalmente mediante un agujero de oxianión dentro del sitio activo. A continuación, el intermedio colapsa de nuevo a un carbonilo, expulsando la primera mitad del sustrato, pero dejando la segunda mitad todavía unida covalentemente a la enzima como un intermedio acil-enzima . Aunque la catálisis ácida general para la descomposición del primer y segundo intermedio tetraédrico puede ocurrir por la vía que se muestra en el diagrama, la evidencia que apoya este mecanismo con quimotripsina [25] ha sido controvertida. [26]
La segunda etapa de la catálisis es la resolución del intermediario acil-enzima mediante el ataque de un segundo sustrato. Si este sustrato es agua, el resultado es la hidrólisis; si es una molécula orgánica, el resultado es la transferencia de esa molécula al primer sustrato. El ataque de este segundo sustrato forma un nuevo intermediario tetraédrico, que se resuelve expulsando el nucleófilo de la enzima, liberando el segundo producto y regenerando la enzima libre. [27]
La cadena lateral del residuo nucleofílico realiza catálisis covalente en el sustrato . El par solitario de electrones presente en el oxígeno o azufre ataca al carbono carbonílico electropositivo . [3] Los 20 aminoácidos biológicos naturales no contienen grupos funcionales suficientemente nucleofílicos para muchas reacciones catalíticas difíciles . La incrustación del nucleófilo en una tríada aumenta su reactividad para una catálisis eficiente. Los nucleófilos más utilizados son el hidroxilo (OH) de la serina y el ion tiol /tiolato (SH/S − ) de la cisteína. [2] Alternativamente, las proteasas de treonina utilizan el hidroxilo secundario de la treonina, sin embargo, debido al impedimento estérico del grupo metilo adicional de la cadena lateral, dichas proteasas utilizan su amida N -terminal como base, en lugar de un aminoácido separado. [1] [28]
El uso de oxígeno o azufre como átomo nucleofílico causa pequeñas diferencias en la catálisis. En comparación con el oxígeno , el orbital d adicional del azufre lo hace más grande (por 0,4 Å) [29] y más suave, le permite formar enlaces más largos (d C-X y d X-H por 1,3 veces), y le da un p K a más bajo (por 5 unidades). [30] Por lo tanto, la serina depende más que la cisteína de la orientación óptima de los miembros de la tríada ácido-base para reducir su p K a [30] con el fin de lograr una desprotonación concertada con catálisis. [2] El bajo p K a de la cisteína funciona en su desventaja en la resolución del primer intermedio tetraédrico , ya que la inversión improductiva del ataque nucleofílico original es el producto de descomposición más favorable. [2] Por lo tanto, la base de la tríada está orientada preferentemente para protonar la amida del grupo saliente para garantizar que se expulse para dejar el azufre de la enzima unido covalentemente al extremo N del sustrato. Finalmente, la resolución de la enzima acil (para liberar el extremo C del sustrato) requiere que la serina se vuelva a protonar, mientras que la cisteína puede salir como S − . Estéricamente , el azufre de la cisteína también forma enlaces más largos y tiene un radio de van der Waals más voluminoso [2] y, si se muta a serina, puede quedar atrapado en orientaciones improductivas en el sitio activo. [29]
Muy raramente, el átomo de selenio del aminoácido poco común selenocisteína se utiliza como nucleófilo. [31] El estado Se − desprotonado se ve fuertemente favorecido cuando se encuentra en una tríada catalítica. [31]
Dado que ningún aminoácido natural es fuertemente nucleofílico, la base en una tríada catalítica polariza y desprotona al nucleófilo para aumentar su reactividad. [3] Además, protona el primer producto para ayudar a la salida del grupo saliente. [32]
La base más común es la histidina, ya que su p K a permite una catálisis básica eficaz, la unión de hidrógeno con el residuo ácido y la desprotonación del residuo nucleófilo. [1] Las β-lactamasas como la TEM-1 utilizan un residuo de lisina como base. Debido a que el p K a de la lisina es tan alto (p K a = 11), un glutamato y varios otros residuos actúan como ácido para estabilizar su estado desprotonado durante el ciclo catalítico. [33] [34] Las proteasas de treonina utilizan su amida N -terminal como base, ya que el hacinamiento estérico por el metilo de la treonina catalítica impide que otros residuos estén lo suficientemente cerca. [35] [36]
El miembro ácido de la tríada forma un enlace de hidrógeno con el residuo básico. Esto alinea el residuo básico al restringir la rotación de su cadena lateral y lo polariza al estabilizar su carga positiva. [3] Dos aminoácidos tienen cadenas laterales ácidas a pH fisiológico (aspartato o glutamato) y, por lo tanto, son los más utilizados para este miembro de la tríada. [3] La proteasa del citomegalovirus [b] utiliza un par de histidinas, una como base, como es habitual, y otra como ácido. [1] La segunda histidina no es un ácido tan eficaz como el aspartato o el glutamato, más comunes, lo que conduce a una menor eficiencia catalítica. [37]
El motivo serina-histidina-aspartato es uno de los motivos catalíticos mejor caracterizados en bioquímica. [3] La tríada está ejemplificada por la quimotripsina , [c] una serina proteasa modelo de la superfamilia PA que utiliza su tríada para hidrolizar cadenas principales de proteínas. El aspartato está unido por hidrógeno a la histidina, lo que aumenta el p Ka de su nitrógeno imidazol de 7 a alrededor de 12. Esto permite que la histidina actúe como una base general poderosa y active el nucleófilo serina. También tiene un agujero de oxianión que consiste en varias amidas de la cadena principal que estabiliza la acumulación de carga en los intermediarios. La base histidina ayuda al primer grupo saliente donando un protón, y también activa el sustrato de agua hidrolítica abstrayendo un protón mientras el OH − restante ataca al intermediario acil-enzima. [23]
La misma tríada también ha evolucionado de manera convergente en las α/β hidrolasas como algunas lipasas y esterasas , sin embargo la orientación de los miembros de la tríada está invertida. [38] [39] Además, también se ha descubierto que la acetil hidrolasa cerebral (que tiene el mismo pliegue que una proteína G pequeña ) tiene esta tríada. [40]
La segunda tríada más estudiada es el motivo cisteína-histidina-aspartato. [2] Varias familias de proteasas de cisteína utilizan este conjunto de tríadas, por ejemplo, la proteasa TEV [a] y la papaína [d] . La tríada actúa de manera similar a las tríadas de proteasas de serina, con algunas diferencias notables. Debido al bajo p K a de la cisteína , la importancia del Asp para la catálisis varía y varias proteasas de cisteína son efectivamente díadas Cys-His (por ejemplo, la proteasa del virus de la hepatitis A ), mientras que en otras la cisteína ya está desprotonada antes de que comience la catálisis (por ejemplo, la papaína). [41] Esta tríada también es utilizada por algunas amidasas, como la N -glicanasa para hidrolizar enlaces CN no peptídicos. [42]
La tríada de la proteasa del citomegalovirus [b] utiliza histidina como miembro tanto del ácido como de la base. La eliminación de la histidina ácida da como resultado una pérdida de actividad de solo diez veces (en comparación con más de diez mil veces cuando se elimina el aspartato de la quimotripsina). Esta tríada se ha interpretado como una posible forma de generar una enzima menos activa para controlar la tasa de escisión. [28]
En las proteasas de sedolisina se encuentra una tríada inusual . [e] El bajo p K a del grupo carboxilato de glutamato significa que solo actúa como base en la tríada a pH muy bajo. Se plantea la hipótesis de que la tríada es una adaptación a entornos específicos como aguas termales ácidas (por ejemplo, kumamolisina) o lisosomas celulares (por ejemplo, tripeptidil peptidasa ). [28]
La proteasa endotelial vasohibina [f] utiliza una cisteína como nucleófilo, pero una serina para coordinar la base de histidina. [43] [44] A pesar de que la serina es un ácido pobre, sigue siendo eficaz para orientar la histidina en la tríada catalítica. [43] Algunos homólogos alternativamente tienen una treonina en lugar de serina en la ubicación del ácido. [43]
Las proteasas de treonina, como la subunidad de proteasa del proteasoma [g] y las aciltransferasas de ornitina [h], utilizan el hidroxilo secundario de la treonina de una manera análoga al uso del hidroxilo primario de la serina . [35] [36] Sin embargo, debido a la interferencia estérica del grupo metilo adicional de la treonina, el miembro base de la tríada es la amida N -terminal que polariza un agua ordenada que, a su vez, desprotona el hidroxilo catalítico para aumentar su reactividad. [1] [28] De manera similar, existen configuraciones equivalentes de "solo serina" y "solo cisteína", como la penicilina acilasa G [i] y la penicilina acilasa V [j] que están relacionadas evolutivamente con las proteasas del proteasoma. Nuevamente, estas utilizan su amida N -terminal como base. [28]
Esta tríada inusual se presenta solo en una superfamilia de amidasas. En este caso, la lisina actúa para polarizar la serina media. [45] La serina media luego forma dos fuertes enlaces de hidrógeno con la serina nucleófila para activarla (uno con el hidroxilo de la cadena lateral y el otro con la amida de la cadena principal). La serina media se mantiene en una orientación cis inusual para facilitar contactos precisos con los otros dos residuos de la tríada. La tríada es aún más inusual en que la lisina y la cis -serina actúan como base para activar la serina catalítica, pero la misma lisina también desempeña el papel del miembro ácido, además de realizar contactos estructurales clave. [45] [46]
El aminoácido selenocisteína (Sec), poco común pero de origen natural, también se puede encontrar como nucleófilo en algunas tríadas catalíticas. [31] La selenocisteína es similar a la cisteína, pero contiene un átomo de selenio en lugar de un átomo de azufre. Un residuo de selenocisteína se encuentra en el sitio activo de la tiorredoxina reductasa , que utiliza el grupo selenol para la reducción del disulfuro en la tiorredoxina. [31]
Además de los tipos naturales de tríadas catalíticas, se ha utilizado la ingeniería de proteínas para crear variantes enzimáticas con aminoácidos no nativos o aminoácidos totalmente sintéticos. [47] Las tríadas catalíticas también se han insertado en proteínas que de otro modo no serían catalíticas o en imitadores de proteínas. [48]
La subtilisina (una serina proteasa) ha tenido su nucleófilo de oxígeno reemplazado con cada uno de azufre, [49] [50] selenio , [51] o telurio . [52] La cisteína y la selenocisteína se insertaron por mutagénesis , mientras que el aminoácido no natural, la telurocisteína , se insertó utilizando células auxotróficas alimentadas con telurocisteína sintética. Estos elementos están todos en la columna 16 de la tabla periódica ( calcógenos ), por lo que tienen propiedades similares. [53] [54] En cada caso, cambiar el nucleófilo redujo la actividad de la proteasa de la enzima, pero aumentó una nueva actividad. Un nucleófilo de azufre mejoró la actividad de la transferasa de la enzima (a veces llamada subtiligasa). Los nucleófilos de selenio y telurio convirtieron la enzima en una oxidorreductasa . [51] [52] Cuando el nucleófilo de la proteasa TEV se convirtió de cisteína a serina, su actividad de proteasa se redujo fuertemente, pero pudo ser restaurada mediante evolución dirigida . [55]
Las proteínas no catalíticas se han utilizado como andamios, con tríadas catalíticas insertadas en ellas que luego se mejoraron mediante evolución dirigida. La tríada Ser-His-Asp se ha insertado en un anticuerpo, [56] así como en una variedad de otras proteínas. [57] De manera similar, se han creado imitadores de tríadas catalíticas en pequeñas moléculas orgánicas como el diseleniuro de diarilo, [58] [59] y se han exhibido en polímeros más grandes como resinas Merrifield , [60] y nanoestructuras de péptidos cortos autoensamblables . [61]
La sofisticación de la red de sitios activos hace que los residuos involucrados en la catálisis (y los residuos en contacto con estos) estén altamente conservados evolutivamente . [62] Sin embargo, hay ejemplos de evolución divergente en tríadas catalíticas, tanto en la reacción catalizada, como en los residuos utilizados en la catálisis. La tríada sigue siendo el núcleo del sitio activo, pero está adaptada evolutivamente para cumplir diferentes funciones. [63] [64] Algunas proteínas, llamadas pseudoenzimas , tienen funciones no catalíticas (por ejemplo, regulación por unión inhibitoria) y han acumulado mutaciones que inactivan su tríada catalítica. [65]
Las tríadas catalíticas realizan la catálisis covalente a través de un intermediario acil-enzima. Si este intermediario se resuelve con agua, el resultado es la hidrólisis del sustrato. Sin embargo, si el intermediario se resuelve mediante el ataque de un segundo sustrato, entonces la enzima actúa como una transferasa . Por ejemplo, el ataque de un grupo acilo da como resultado una reacción de aciltransferasa . Varias familias de enzimas transferasas han evolucionado a partir de hidrolasas por adaptación para excluir el agua y favorecer el ataque de un segundo sustrato. [66] En diferentes miembros de la superfamilia α/β-hidrolasa, la tríada Ser-His-Asp está ajustada por los residuos circundantes para realizar al menos 17 reacciones diferentes. [39] [67] Algunas de estas reacciones también se logran con mecanismos que han alterado la formación o resolución del intermediario acil-enzima, o que no proceden a través de un intermediario acil-enzima. [39]
Además, se ha desarrollado un mecanismo de transferasa alternativo mediante la amidofosforibosiltransferasa , que tiene dos sitios activos. [k] En el primer sitio activo, una tríada de cisteína hidroliza un sustrato de glutamina para liberar amoníaco libre. Luego, el amoníaco se difunde a través de un túnel interno en la enzima hasta el segundo sitio activo, donde se transfiere a un segundo sustrato. [68] [69]
La evolución divergente de los residuos del sitio activo es lenta, debido a fuertes restricciones químicas. Sin embargo, algunas superfamilias de proteasas han evolucionado de un nucleófilo a otro. Esto se puede inferir cuando una superfamilia (con el mismo plegamiento ) contiene familias que utilizan diferentes nucleófilos. [55] Estos cambios de nucleófilos han ocurrido varias veces durante la historia evolutiva, sin embargo, los mecanismos por los cuales esto sucede aún no están claros. [17] [55]
Dentro de las superfamilias de proteasas que contienen una mezcla de nucleófilos (por ejemplo, el clan PA ), las familias se designan por su nucleófilo catalítico (C = proteasas de cisteína, S = proteasas de serina).
Otra subclase de variantes de la tríada catalítica son las pseudoenzimas , que tienen mutaciones de tríada que las hacen catalíticamente inactivas, pero capaces de funcionar como proteínas de unión o estructurales. [71] [72] Por ejemplo, la proteína de unión a heparina Azurocidina es un miembro del clan PA, pero con una glicina en lugar del nucleófilo y una serina en lugar de la histidina. [73] De manera similar, RHBDF1 es un homólogo de las proteasas romboides de la familia S54 con una alanina en lugar de la serina nucleófila. [74] [75] En algunos casos, las pseudoenzimas aún pueden tener una tríada catalítica intacta, pero las mutaciones en el resto de la proteína eliminan la actividad catalítica. El clan CA contiene miembros catalíticamente inactivos con tríadas mutadas ( la calpamodulina tiene lisina en lugar de su nucleófilo cisteína) y con tríadas intactas pero mutaciones inactivadoras en otras partes (la testina de rata conserva una tríada Cys-His-Asn). [76]
La enzimología de las proteasas proporciona algunos de los ejemplos más claros conocidos de evolución convergente a nivel molecular. La misma disposición geométrica de los residuos de la tríada se da en más de 20 superfamilias de enzimas distintas . Cada una de estas superfamilias es el resultado de la evolución convergente para la misma disposición de la tríada dentro de un pliegue estructural diferente . Esto se debe a que existen formas productivas limitadas de organizar tres residuos de la tríada, la cadena principal de la enzima y el sustrato. Estos ejemplos reflejan las limitaciones químicas y físicas intrínsecas de las enzimas, lo que lleva a la evolución a converger repetida e independientemente en soluciones equivalentes. [1] [2]
Las mismas geometrías de tríadas han convergido en las serina proteasas, como las superfamilias de quimotripsina [c] y subtilisina . Se ha producido una evolución convergente similar con las cisteína proteasas, como la proteasa viral C3 y las superfamilias de papaína [d] . Estas tríadas han convergido en casi la misma disposición debido a las similitudes mecanísticas en los mecanismos de proteólisis de cisteína y serina . [2]
Familias de cisteína proteasas
Familias de serina proteasas
Las proteasas de treonina utilizan el aminoácido treonina como su nucleófilo catalítico. A diferencia de la cisteína y la serina, la treonina es un hidroxilo secundario (es decir, tiene un grupo metilo). Este grupo metilo restringe en gran medida las posibles orientaciones de la tríada y el sustrato, ya que el metilo choca con la cadena principal de la enzima o con la base de histidina. [2] Cuando el nucleófilo de una proteasa de serina se mutó a treonina, el metilo ocupó una mezcla de posiciones, la mayoría de las cuales impidieron la unión del sustrato. [77] En consecuencia, el residuo catalítico de una proteasa de treonina se encuentra en su extremo N -terminal. [2]
Se sabe que dos superfamilias de enzimas evolutivamente independientes con diferentes pliegues de proteínas utilizan el residuo N -terminal como nucleófilo: la superfamilia PB (proteasomas que utilizan el pliegue Ntn) [35] y la superfamilia PE ( acetiltransferasas que utilizan el pliegue DOM) [36] . Esta similitud de la estructura del sitio activo en pliegues de proteínas completamente diferentes indica que el sitio activo evolucionó de manera convergente en esas superfamilias. [2] [28]
Familias de proteasas de treonina
