Tipo de microscopio con electrones como fuente de iluminación.
Un microscopio electrónico de transmisión del año 2002Una imagen de una hormiga en un microscopio electrónico de barrido.
Un microscopio electrónico es un microscopio que utiliza un haz de electrones como fuente de iluminación. Utilizan ópticas electrónicas análogas a las lentes de vidrio de un microscopio óptico de luz para controlar el haz de electrones, por ejemplo, enfocándolos para producir imágenes ampliadas o patrones de difracción de electrones . Como la longitud de onda de un electrón puede ser hasta 100.000 veces menor que la de la luz visible, los microscopios electrónicos tienen una resolución mucho mayor de aproximadamente 0,1 nm, que se compara con los aproximadamente 200 nm de los microscopios ópticos . [1] El microscopio electrónico puede referirse a:
Puede encontrar más detalles en los enlaces anteriores. Este artículo contiene información general, principalmente sobre microscopios electrónicos de transmisión.
Historia
Reproducción de un microscopio electrónico antiguo construido por Ernst Ruska en la década de 1930
Muchos avances sentaron las bases de la óptica electrónica utilizada en microscopios. [2] Un paso significativo fue el trabajo de Hertz en 1883 [3], quien fabricó un tubo de rayos catódicos con deflexión electrostática y magnética, demostrando la manipulación de la dirección de un haz de electrones. Otros avances fueron el enfoque de los electrones mediante un campo magnético axial por Emil Wiechert en 1899, [4] los cátodos recubiertos de óxido mejorados que producían más electrones por Arthur Wehnelt en 1905 [5] y el desarrollo de la lente electromagnética en 1926 por Hans Busch . [6] Según Dennis Gabor , el físico Leó Szilárd intentó en 1928 convencerlo de que construyera un microscopio electrónico, para el que Szilárd había presentado una patente. [7]
Hasta el día de hoy, la cuestión de quién inventó el microscopio electrónico de transmisión es controvertida. [8] [9] [10] [11] En 1928, en la Technische Hochschule de Charlottenburg (ahora Technische Universität Berlin ), Adolf Matthias (profesor de tecnología de alto voltaje e instalaciones eléctricas) nombró a Max Knoll para dirigir un equipo de investigadores para avanzar en la investigación sobre haces de electrones y osciloscopios de rayos catódicos. El equipo estaba formado por varios estudiantes de doctorado, incluido Ernst Ruska . En 1931, Max Knoll y Ernst Ruska [12] [13] generaron con éxito imágenes magnificadas de rejillas de malla colocadas sobre una abertura de ánodo. El dispositivo, una réplica del cual se muestra en la figura, utilizó dos lentes magnéticas para lograr mayores aumentos, el primer microscopio electrónico. (Max Knoll murió en 1969, por lo que no recibió una parte del premio Nobel de 1986 por la invención de los microscopios electrónicos).
Aparentemente, el trabajo de Reinhold Rüdenberg en Siemens-Schuckert fue independiente . Según la ley de patentes (patentes de EE. UU. n.º 2058914 [14] y 2070318 [15] , ambas presentadas en 1932), es el inventor del microscopio electrónico, pero no está claro cuándo tuvo un instrumento funcional. En un artículo muy breve de 1932 [16] afirmó que Siemens había estado trabajando en esto durante algunos años antes de que se presentaran las patentes en 1932, afirmando que su esfuerzo fue paralelo al desarrollo universitario. Murió en 1961, por lo que, al igual que Max Knoll, no fue elegible para una parte del premio Nobel de 1986. [17]
Al año siguiente, 1933, Ruska y Knoll construyeron el primer microscopio electrónico que superaba la resolución de un microscopio óptico (de luz). [18] Cuatro años más tarde, en 1937, Siemens financió el trabajo de Ernst Ruska y Bodo von Borries , y empleó a Helmut Ruska , hermano de Ernst, para desarrollar aplicaciones para el microscopio, especialmente con muestras biológicas. [18] [19] También en 1937, Manfred von Ardenne fue pionero en el microscopio electrónico de barrido . [20] Siemens produjo el primer microscopio electrónico comercial en 1938. [21] Los primeros microscopios electrónicos norteamericanos fueron construidos en la década de 1930, en la Universidad Estatal de Washington por Anderson y Fitzsimmons [22] y en la Universidad de Toronto por Eli Franklin Burton y los estudiantes Cecil Hall, James Hillier y Albert Prebus. Siemens produjo un microscopio electrónico de transmisión (MET) en 1939. [23] Aunque los microscopios electrónicos de transmisión actuales tienen una capacidad de ampliación de dos millones de veces, como instrumentos científicos siguen siendo similares pero con una óptica mejorada.
En la década de 1940, se desarrollaron microscopios electrónicos de alta resolución, lo que permitió un mayor aumento y resolución. [24] En 1965, Albert Crewe en la Universidad de Chicago introdujo el microscopio electrónico de transmisión de barrido utilizando una fuente de emisión de campo , [25] lo que permitió microscopios de barrido de alta resolución. [26] A principios de la década de 1980, las mejoras en la estabilidad mecánica, así como el uso de voltajes de aceleración más altos, permitieron la obtención de imágenes de materiales a escala atómica. [27] [28] En la década de 1980, el cañón de emisión de campo se volvió común para los microscopios electrónicos, mejorando la calidad de la imagen debido a la coherencia adicional y las aberraciones cromáticas más bajas. La década de 2000 estuvo marcada por avances en la microscopía electrónica con corrección de aberraciones, lo que permitió mejoras significativas en la resolución y claridad de las imágenes. [29] [30]
Tipos
Principio de funcionamiento de un microscopio electrónico de transmisión
Microscopio electrónico de transmisión (MET)
La forma original del microscopio electrónico, el microscopio electrónico de transmisión (MET), utiliza un haz de electrones de alto voltaje para iluminar la muestra y crear una imagen. Un haz de electrones se produce mediante un cañón de electrones , con electrones que normalmente tienen energías en el rango de 20 a 400 keV, enfocados por lentes electromagnéticas y transmitidos a través de la muestra. Cuando emerge de la muestra, el haz de electrones lleva información sobre la estructura de la muestra que se magnifica mediante lentes del microscopio. La variación espacial de esta información (la "imagen") puede verse proyectando la imagen electrónica magnificada sobre un detector . Por ejemplo, la imagen puede ser vista directamente por un operador utilizando una pantalla de visualización fluorescente recubierta con un fósforo o material centelleador como sulfuro de cinc . Un fósforo de alta resolución también puede estar acoplado por medio de un sistema óptico de lentes o una guía de luz de fibra óptica al sensor de una cámara digital . Los detectores de electrones directos no tienen centelleador y están expuestos directamente al haz de electrones, lo que soluciona algunas de las limitaciones de las cámaras acopladas a centelleador. [31]
La resolución de los TEM está limitada principalmente por la aberración esférica , pero una nueva generación de correctores de hardware puede reducir la aberración esférica para aumentar la resolución en la microscopía electrónica de transmisión de alta resolución (HRTEM) por debajo de 0,5 angstroms (50 picómetros ), [32] lo que permite aumentos superiores a 50 millones de veces. [33] La capacidad de HRTEM para determinar las posiciones de los átomos dentro de los materiales es útil para la investigación y el desarrollo de nanotecnologías. [34]
Microscopio electrónico de transmisión por barrido (STEM)
El STEM hace que una sonda incidente enfocada pase a través de una muestra. De este modo, la alta resolución del TEM es posible en el STEM. La acción de enfoque (y las aberraciones) ocurren antes de que los electrones golpeen la muestra en el STEM, pero después en el TEM. El uso del STEM de un rasterizado de haz similar al del SEM simplifica la obtención de imágenes de campo oscuro anular y otras técnicas analíticas, pero también significa que los datos de imagen se adquieren en serie en lugar de en paralelo. [35]
Microscopio electrónico de barrido (SEM)
Principio de funcionamiento de un microscopio electrónico de barridoImagen de Bacillus subtilis tomada con un microscopio electrónico de la década de 1960
El SEM produce imágenes al sondear la muestra con un haz de electrones enfocado que se escanea a través de la muestra ( escaneo de trama ). Cuando el haz de electrones interactúa con la muestra, pierde energía por una variedad de mecanismos. Estas interacciones conducen, entre otros eventos, a la emisión de electrones secundarios de baja energía y electrones retrodispersados de alta energía, emisión de luz ( catodoluminiscencia ) o emisión de rayos X , todos los cuales proporcionan señales que transportan información sobre las propiedades de la superficie de la muestra, como su topografía y composición. La imagen mostrada por SEM representa la intensidad variable de cualquiera de estas señales en la imagen en una posición correspondiente a la posición del haz en la muestra cuando se generó la señal. [36]
Los SEM se diferencian de los TEM en que utilizan electrones con energía mucho menor, generalmente por debajo de los 20 keV, [37] mientras que los TEM generalmente utilizan electrones con energías en el rango de 80-300 keV. [38] Por lo tanto, las fuentes de electrones y la óptica de los dos microscopios tienen diseños diferentes y normalmente son instrumentos separados. [39]
Principales modos de funcionamiento
Imágenes de contraste de difracción
Imágenes de contraste de fase
Imágenes de alta resolución
Análisis químico
Difracción de electrones
Los microscopios electrónicos de transmisión se pueden utilizar en modo de difracción de electrones , donde se produce un mapa de los ángulos de los electrones que salen de la muestra. Las ventajas de la difracción de electrones sobre la cristalografía de rayos X se encuentran principalmente en el tamaño de los cristales. En la cristalografía de rayos X, los cristales son comúnmente visibles a simple vista y generalmente tienen cientos de micrómetros de longitud. En comparación, los cristales para la difracción de electrones deben tener menos de unos pocos cientos de nanómetros de espesor y no tienen límite inferior de tamaño. Además, la difracción de electrones se realiza en un TEM, que también se puede utilizar para obtener muchos otros tipos de información, en lugar de requerir un instrumento separado. [40] [38]
Preparación de muestras para TEM
Un insecto recubierto de oro para observar con un microscopio electrónico de barrido.
Los materiales que se van a observar en un microscopio electrónico de transmisión pueden requerir un procesamiento para producir una muestra adecuada. La técnica requerida varía según la muestra y el análisis requerido:
Criofijación : congelación de una muestra para que el agua forme hielo vítreo (no cristalino) . Esto preserva la muestra en una instantánea de su estado nativo. Los métodos para lograr esta vitrificación incluyen la congelación por inmersión rápida en etano líquido y la congelación a alta presión. Un campo completo llamado microscopía crioelectrónica se ha ramificado a partir de esta técnica. Con el desarrollo de la microscopía crioelectrónica de secciones vítreas (CEMOVIS) [42] yel fresado de láminas con haz de iones crioenfocado, [43] ahora es posible observar muestras de prácticamente cualquier muestra biológica cerca de su estado nativo.
Inclusión de muestras biológicas : después de la deshidratación, el tejido que se va a observar en el microscopio electrónico de transmisión se incrusta para que pueda seccionarse y estar listo para su visualización. Para ello, el tejido se pasa a través de un "disolvente de transición" como óxido de propileno (epoxipropano) o acetona y luego se infiltra con una resina epoxi como Araldite , Epon o Durcupan ; [44] los tejidos también se pueden incrustar directamente en resina acrílica miscible en agua . Después de que la resina se haya polimerizado (endurecido), la muestra se secciona mediante ultramicrotomía y se tiñe . [ cita requerida ]
Incrustaciones, materiales : después de incrustarlas en resina, la muestra generalmente se esmerila y se pule hasta obtener un acabado tipo espejo utilizando abrasivos ultrafinos. [ cita requerida ]
Fractura por congelación o grabado por congelación : un método de preparación [45] [46] [47] particularmente útil para examinar las membranas lipídicas y sus proteínas incorporadas en una vista "frontal". [48] [49] [50]La congelación-fracturación ayuda a pelar las membranas para permitir la visualización de lo que hay dentro.Cara externa de la membrana de la levadura de panadería que muestra los pequeños agujeros por donde se fracturan las proteínas, a veces como pequeños patrones de anillos.El tejido fresco o la suspensión celular se congela rápidamente (criofijación) y luego se fractura rompiéndolo [51] (o utilizando un micrótomo) [50] mientras se mantiene a temperatura de nitrógeno líquido. La superficie fracturada fría (a veces "grabada" aumentando la temperatura a aproximadamente -100 °C durante varios minutos para dejar que algo de hielo sublime) [50] luego se cubre con platino u oro evaporado en un ángulo promedio de 45° en un evaporador de alto vacío. La segunda capa de carbono, evaporada perpendicularmente al plano de superficie promedio, se aplica a menudo para mejorar la estabilidad del recubrimiento de réplica. La muestra se devuelve a temperatura y presión ambiente, luego la réplica de metal "pre-sombreada" extremadamente frágil de la superficie de la fractura se libera del material biológico subyacente mediante una cuidadosa digestión química con ácidos, solución de hipoclorito o detergente SDS . La réplica que aún flota se lava completamente para eliminar los químicos residuales, se pesca cuidadosamente en rejillas finas, se seca y luego se observa en el TEM. [ cita requerida ]
Marcaje de oro inmunológico de réplicas de congelación de fracturas (FRIL) : el método de congelación de fracturas se ha modificado para permitir la identificación de los componentes de la cara de la fractura mediante el marcaje de oro inmunológico. En lugar de eliminar todo el tejido subyacente de la réplica descongelada como paso final antes de verla en el microscopio, el espesor del tejido se minimiza durante o después del proceso de fractura. La capa delgada de tejido permanece unida a la réplica de metal para que pueda marcarse con oro inmunológico con anticuerpos contra las estructuras elegidas. La capa delgada de la muestra original sobre la réplica con oro adherido permite la identificación de estructuras en el plano de fractura. [52] También existen métodos relacionados que marcan la superficie de las células grabadas [53] y otras variaciones del marcaje de réplicas. [54]
Fresado por haz de iones : adelgaza las muestras hasta que son transparentes a los electrones disparando iones (normalmente argón ) a la superficie desde un ángulo y pulverizando material desde la superficie. Una subclase de esto es el fresado por haz de iones enfocado , en el que se utilizan iones de galio para producir una membrana o "lámina" transparente a los electrones en una región específica de la muestra, por ejemplo, a través de un dispositivo dentro de un microprocesador o un microscopio electrónico de barrido (SEM) con haz de iones enfocado . El fresado por haz de iones también se puede utilizar para pulir secciones transversales antes del análisis de materiales que son difíciles de preparar mediante pulido mecánico. [ cita requerida ]
Tinción negativa : las suspensiones que contienen nanopartículas o material biológico fino (como virus y bacterias) se mezclan brevemente con una solución diluida de una solución opaca a los electrones, como molibdato de amonio, acetato de uranilo (o formato) o ácido fosfotúngstico . [ cita requerida ] Esta mezcla se aplica a una rejilla EM, recubierta previamente con una película de plástico como formvar, se seca y luego se deja secar. La visualización de esta preparación en el TEM debe realizarse sin demora para obtener mejores resultados. El método es importante en microbiología para una identificación morfológica rápida pero cruda, pero también se puede utilizar como base para la reconstrucción 3D de alta resolución utilizando la metodología de tomografía EM cuando se utilizan películas de carbono como soporte.
Corte : produce cortes finos de la muestra, semitransparentes a los electrones. Estos se pueden cortar mediante ultramicrotomía en un ultramicrotomo con un cuchillo de vidrio o diamante para producir cortes ultradelgados de aproximadamente 60 a 90 nm de espesor. También se utilizan cuchillos de vidrio desechables porque se pueden hacer en el laboratorio y son mucho más económicos. También se pueden crear cortes in situ mediante fresado en un microscopio electrónico de barrido con haz de iones enfocado , donde la sección se conoce como lámina. [43]
Tinción : utiliza metales pesados como plomo , uranio o tungsteno para dispersar los electrones de la imagen y así dar contraste entre diferentes estructuras, ya que muchos materiales (especialmente biológicos) son casi "transparentes" a los electrones (objetos de fase débil). En biología, las muestras se pueden teñir "en bloque" antes de incluirlas y también más tarde después de seccionarlas. Normalmente, las secciones delgadas se tiñen durante varios minutos con una solución acuosa o alcohólica de acetato de uranilo seguida de citrato de plomo acuoso. [55]
Flujos de trabajo de EM
En sus configuraciones más comunes, los microscopios electrónicos producen imágenes con un único valor de brillo por píxel, y los resultados suelen presentarse en escala de grises . [56] Sin embargo, a menudo estas imágenes se colorean mediante el uso de software de detección de características o simplemente mediante edición manual con un editor de gráficos. Esto se puede hacer para aclarar la estructura o por efecto estético y, por lo general, no agrega información nueva sobre la muestra. [57]
En la actualidad, los microscopios electrónicos se utilizan con frecuencia en flujos de trabajo más complejos, y cada uno de ellos suele utilizar múltiples tecnologías para permitir análisis más complejos o más cuantitativos de una muestra. A continuación se describen algunos ejemplos, pero no se debe considerar que esta es una lista exhaustiva. La elección del flujo de trabajo dependerá en gran medida de la aplicación y de los requisitos de las preguntas científicas correspondientes, como la resolución, el volumen, la naturaleza de la molécula objetivo, etc.
Por ejemplo, las imágenes de la microscopía óptica y electrónica de la misma región de una muestra se pueden superponer para correlacionar los datos de las dos modalidades. Esto se utiliza habitualmente para proporcionar información EM contextual de mayor resolución sobre una estructura marcada con fluorescencia. Esta microscopía óptica y electrónica correlativa ( CLEM ) [58] es uno de los diversos flujos de trabajo correlativos disponibles en la actualidad. Otro ejemplo es la espectrometría de masas de alta resolución (microscopía iónica), que se ha utilizado para proporcionar información correlativa sobre la localización subcelular de antibióticos, [59] datos que serían difíciles de obtener por otros medios.
El papel inicial de los microscopios electrónicos en la obtención de imágenes de cortes bidimensionales (TEM) o de la superficie de una muestra (SEM con electrones secundarios) también se ha expandido cada vez más hacia la profundidad de las muestras. [60] Un ejemplo temprano de estos flujos de trabajo de "EM de volumen" fue simplemente apilar imágenes TEM de secciones seriadas cortadas a través de una muestra. El siguiente desarrollo fue la reconstrucción virtual de un volumen de sección gruesa (200-500 nm) mediante retroproyección de un conjunto de imágenes tomadas en diferentes ángulos de inclinación: tomografía TEM . [61]
Imágenes seriadas para EM de volumen
Para adquirir conjuntos de datos EM de volumen de profundidades mayores que la tomografía TEM (micrómetros o milímetros en el eje z), se puede utilizar una serie de imágenes tomadas a través de la profundidad de la muestra. Por ejemplo, se pueden obtener imágenes de cintas de secciones en serie en un TEM como se describió anteriormente, y cuando se utilizan secciones más gruesas, se puede utilizar la tomografía TEM en serie para aumentar la resolución z. Más recientemente, se pueden adquirir imágenes de electrones retrodispersados (BSE) de una serie más grande de secciones recolectadas en obleas de silicio, conocidas como tomografía de matriz SEM. [62] [63] Un enfoque alternativo es utilizar BSE SEM para obtener imágenes de la superficie del bloque en lugar de la sección, después de que se haya eliminado cada sección. Con este método, un ultramicrótomo instalado en una cámara SEM puede aumentar la automatización del flujo de trabajo; el bloque de muestra se carga en la cámara y el sistema se programa para cortar y obtener imágenes de la muestra de forma continua. Esto se conoce como SEM de cara de bloque en serie. [64] Un método relacionado utiliza fresado de haz de iones enfocado en lugar de un ultramicrótomo para eliminar secciones. En estos métodos de obtención de imágenes en serie, el resultado es esencialmente una secuencia de imágenes a través de un bloque de muestra que se puede alinear digitalmente en secuencia y, por lo tanto, reconstruir en un conjunto de datos EM de volumen. El mayor volumen disponible en estos métodos ha ampliado la capacidad de la microscopía electrónica para abordar nuevas preguntas, [60] como el mapeo de la conectividad neuronal en el cerebro, [65] y los sitios de contacto de membrana entre orgánulos. [66]
Los microscopios electrónicos son costosos de construir y mantener. Los microscopios diseñados para lograr altas resoluciones deben estar alojados en edificios estables (a veces subterráneos) con servicios especiales, como sistemas de cancelación de campos magnéticos. [67]
Los microscopios electrónicos de barrido que funcionan en modo de alto vacío convencional suelen obtener imágenes de muestras conductoras; por lo tanto, los materiales no conductores requieren un revestimiento conductor (aleación de oro/paladio, carbono, osmio, etc.). El modo de bajo voltaje de los microscopios modernos permite la observación de muestras no conductoras sin revestimiento. Los materiales no conductores también se pueden obtener imágenes con un microscopio electrónico de barrido de presión variable (o ambiental). [ cita requerida ]
Las muestras pequeñas y estables, como los nanotubos de carbono , las frústulas de diatomeas y los pequeños cristales minerales (fibras de amianto, por ejemplo) no requieren un tratamiento especial antes de ser examinadas en el microscopio electrónico. Las muestras de materiales hidratados, incluidas casi todas las muestras biológicas, deben prepararse de diversas maneras para estabilizarlas, reducir su espesor (corte ultrafino) y aumentar su contraste óptico electrónico (tinción). Estos procesos pueden dar lugar a artefactos , pero estos suelen poder identificarse comparando los resultados obtenidos utilizando métodos de preparación de muestras radicalmente diferentes. Desde la década de 1980, el análisis de muestras criofijadas y vitrificadas también se ha utilizado cada vez más por los científicos, lo que confirma aún más la validez de esta técnica. [70] [71] [72]
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