Un anticuerpo monoclonal ( mAb , más raramente llamado moAb ) es un anticuerpo producido a partir de un linaje celular creado mediante la clonación de un glóbulo blanco único . Todos los anticuerpos posteriores derivados de esta manera se remontan a una célula madre única.
Los anticuerpos monoclonales pueden tener afinidad monovalente, es decir, unirse solo al mismo epítopo (la parte de un antígeno que reconoce el anticuerpo). [3] Por el contrario, los anticuerpos policlonales se unen a múltiples epítopos y suelen estar formados por diferentes linajes de células plasmáticas secretoras de anticuerpos . Los anticuerpos monoclonales biespecíficos también pueden diseñarse mediante el aumento de los objetivos terapéuticos de un anticuerpo monoclonal a dos epítopos.
Es posible producir anticuerpos monoclonales que se unan específicamente a casi cualquier sustancia adecuada; luego pueden servir para detectarla o purificarla. Esta capacidad se ha convertido en una herramienta de investigación en bioquímica , biología molecular y medicina . Los anticuerpos monoclonales se utilizan en el diagnóstico de enfermedades como el cáncer y las infecciones [4] y se utilizan terapéuticamente en el tratamiento de, por ejemplo, el cáncer y las enfermedades inflamatorias .
A principios del siglo XX, el inmunólogo Paul Ehrlich propuso la idea de un Zauberkugel , una " bala mágica ", concebida como un compuesto que atacaba selectivamente a un organismo causante de una enfermedad y podía administrar una toxina a dicho organismo. Esto sirvió de base al concepto de anticuerpos monoclonales y conjugados farmacológicos monoclonales. Ehrlich y Élie Metchnikoff recibieron en 1908 el Premio Nobel de Fisiología o Medicina por proporcionar la base teórica de la inmunología.
En la década de 1970, se conocían linfocitos que producían un solo anticuerpo, en forma de mieloma múltiple , un cáncer que afectaba a las células B. Estos anticuerpos anormales o paraproteínas se usaban para estudiar la estructura de los anticuerpos, pero aún no era posible producir anticuerpos idénticos específicos para un antígeno dado . [5] : 324 En 1973, Jerrold Schwaber describió la producción de anticuerpos monoclonales utilizando células híbridas humano-ratón. [6] Este trabajo sigue siendo ampliamente citado entre los que utilizan hibridomas derivados de humanos . [7] En 1975, Georges Köhler y César Milstein lograron realizar fusiones de líneas celulares de mieloma con células B para crear hibridomas que podían producir anticuerpos, específicos para antígenos conocidos y que fueron inmortalizados. [8] Ellos y Niels Kaj Jerne compartieron el Premio Nobel de Fisiología o Medicina en 1984 por el descubrimiento. [8]
En 1988, Gregory Winter y su equipo fueron pioneros en las técnicas para humanizar los anticuerpos monoclonales, [9] eliminando las reacciones que muchos anticuerpos monoclonales causaban en algunos pacientes. En la década de 1990, la investigación estaba avanzando en el uso terapéutico de los anticuerpos monoclonales y, en 2018, James P. Allison y Tasuku Honjo recibieron el Premio Nobel de Fisiología o Medicina por su descubrimiento de la terapia contra el cáncer mediante la inhibición de la regulación inmunitaria negativa, utilizando anticuerpos monoclonales que evitan los enlaces inhibidores. [10]
El trabajo de traducción necesario para implementar estas ideas se atribuye a Lee Nadler. Como se explica en un artículo del NIH, "fue el primero en descubrir anticuerpos monoclonales dirigidos contra antígenos específicos de células B humanas y, de hecho, todos los antígenos específicos de células B humanas conocidos se descubrieron en su laboratorio. Es un verdadero investigador de traducción, ya que utilizó estos anticuerpos monoclonales para clasificar la leucemia y los linfomas de células B humanas, así como para crear agentes terapéuticos para pacientes... Más importante aún, fue el primero en el mundo en administrar un anticuerpo monoclonal a un ser humano (un paciente con linfoma de células B)". [11]
Gran parte del trabajo detrás de la producción de anticuerpos monoclonales se basa en la producción de hibridomas, que implica la identificación de células plasmáticas/plasmablastos específicos de antígeno que producen anticuerpos específicos para un antígeno de interés y la fusión de estas células con células de mieloma . [8] Las células B de conejo se pueden utilizar para formar un hibridoma de conejo . [12] [13] El polietilenglicol se utiliza para fusionar membranas plasmáticas adyacentes, [14] pero la tasa de éxito es baja, por lo que se utiliza un medio selectivo en el que solo las células fusionadas pueden crecer. Esto es posible porque las células de mieloma han perdido la capacidad de sintetizar hipoxantina-guanina-fosforribosil transferasa (HGPRT), una enzima necesaria para la síntesis de rescate de ácidos nucleicos. La ausencia de HGPRT no es un problema para estas células a menos que la vía de síntesis de purina de novo también se interrumpa. La exposición de las células a la aminopterina (un análogo del ácido fólico que inhibe la dihidrofolato reductasa ) las vuelve incapaces de utilizar la vía de novo y se vuelven totalmente auxotróficas para los ácidos nucleicos , por lo que requieren suplementación para sobrevivir.
El medio de cultivo selectivo se denomina medio HAT porque contiene hipoxantina , aminopterina y timidina . Este medio es selectivo para las células fusionadas ( hibridoma ). Las células de mieloma no fusionadas no pueden crecer porque carecen de HGPRT y, por lo tanto, no pueden replicar su ADN. Las células del bazo no fusionadas no pueden crecer indefinidamente debido a su vida útil limitada. Solo las células híbridas fusionadas, denominadas hibridomas, pueden crecer indefinidamente en el medio porque la célula del bazo asociada proporciona HGPRT y la célula asociada del mieloma tiene características que la hacen inmortal (similar a una célula cancerosa).
Esta mezcla de células se diluye y se cultivan clones a partir de células madre individuales en pocillos de microtitulación. A continuación, se analiza la capacidad de los anticuerpos secretados por los diferentes clones para unirse al antígeno (con una prueba como ELISA o ensayo de microarray de antígenos) o inmunotransferencia . A continuación, se selecciona el clon más productivo y estable para su uso futuro.
Los hibridomas pueden cultivarse indefinidamente en un medio de cultivo celular adecuado. También pueden inyectarse en ratones (en la cavidad peritoneal , que rodea el intestino). Allí, producen tumores que secretan un líquido rico en anticuerpos llamado líquido ascítico .
El medio debe enriquecerse durante la selección in vitro para favorecer aún más el crecimiento del hibridoma. Esto se puede lograr mediante el uso de una capa de células fibrocíticas alimentadoras o un medio suplementario como briclone. Se pueden utilizar medios de cultivo acondicionados por macrófagos. La producción en cultivo celular suele preferirse ya que la técnica de ascitis es dolorosa para el animal. Cuando existen técnicas alternativas, la ascitis se considera poco ética . [15]
Recientemente se han desarrollado varias tecnologías de anticuerpos monoclonales, [16] como la visualización de fagos , [17] el cultivo de células B individuales, [18] la amplificación de células individuales de varias poblaciones de células B [19] [20] [21] [22] [23] y las tecnologías de interrogación de células plasmáticas individuales. A diferencia de la tecnología tradicional de hibridomas, las tecnologías más nuevas utilizan técnicas de biología molecular para amplificar las cadenas pesadas y ligeras de los genes de anticuerpos mediante PCR y producir en sistemas bacterianos o mamíferos con tecnología recombinante . Una de las ventajas de las nuevas tecnologías es que se pueden aplicar a múltiples animales, como conejos, llamas, pollos y otros animales experimentales comunes en el laboratorio.
Después de obtener una muestra de medio de cultivo de hibridomas o una muestra de líquido ascítico, se deben extraer los anticuerpos deseados. Los contaminantes de la muestra de cultivo celular consisten principalmente en componentes del medio, como factores de crecimiento, hormonas y transferrinas . Por el contrario, es probable que la muestra in vivo tenga anticuerpos del huésped, proteasas , nucleasas , ácidos nucleicos y virus . En ambos casos, pueden estar presentes otras secreciones de los hibridomas, como citocinas . También puede haber contaminación bacteriana y, como resultado, endotoxinas secretadas por las bacterias. Dependiendo de la complejidad del medio requerido en el cultivo celular y, por lo tanto, de los contaminantes, puede ser preferible uno u otro método ( in vivo o in vitro ).
La muestra se acondiciona primero o se prepara para la purificación. Las células, los restos celulares, los lípidos y el material coagulado se eliminan primero, normalmente mediante centrifugación seguida de filtración con un filtro de 0,45 μm. Estas partículas grandes pueden provocar un fenómeno llamado ensuciamiento de la membrana en pasos de purificación posteriores. Además, la concentración de producto en la muestra puede no ser suficiente, especialmente en casos en los que el anticuerpo deseado es producido por una línea celular de baja secreción. Por lo tanto, la muestra se concentra mediante ultrafiltración o diálisis .
La mayoría de las impurezas cargadas son generalmente aniones como ácidos nucleicos y endotoxinas. Estos pueden separarse mediante cromatografía de intercambio iónico . [24] La cromatografía de intercambio catiónico se utiliza a un pH suficientemente bajo como para que el anticuerpo deseado se una a la columna mientras los aniones fluyen a través de ella, o la cromatografía de intercambio aniónico se utiliza a un pH suficientemente alto como para que el anticuerpo deseado fluya a través de la columna mientras los aniones se unen a él. Varias proteínas también se pueden separar junto con los aniones en función de su punto isoeléctrico (pI). En las proteínas, el punto isoeléctrico (pI) se define como el pH en el que una proteína no tiene carga neta. Cuando el pH > pI, una proteína tiene una carga neta negativa, y cuando el pH < pI, una proteína tiene una carga neta positiva. Por ejemplo, la albúmina tiene un pI de 4,8, que es significativamente menor que el de la mayoría de los anticuerpos monoclonales, que tienen un pI de 6,1. Por lo tanto, a un pH entre 4,8 y 6,1, es probable que la carga media de las moléculas de albúmina sea más negativa, mientras que las moléculas de mAb tienen carga positiva y, por lo tanto, es posible separarlas. La transferrina, por otro lado, tiene un pI de 5,9, por lo que no se puede separar fácilmente con este método. Una diferencia de pI de al menos 1 es necesaria para una buena separación.
La transferrina puede eliminarse mediante cromatografía de exclusión molecular . Este método es una de las técnicas cromatográficas más fiables. Dado que se trata de proteínas, las propiedades como la carga y la afinidad no son constantes y varían con el pH a medida que las moléculas se protonan y desprotonan, mientras que el tamaño se mantiene relativamente constante. No obstante, tiene desventajas como baja resolución, baja capacidad y tiempos de elución reducidos .
Un método de separación mucho más rápido y de un solo paso es la cromatografía de afinidad de proteína A/G . El anticuerpo se une selectivamente a la proteína A/G, por lo que se obtiene un alto nivel de pureza (generalmente >80%). Las condiciones generalmente duras de este método pueden dañar los anticuerpos que se dañan fácilmente. Un pH bajo puede romper los enlaces y eliminar el anticuerpo de la columna. Además de afectar posiblemente al producto, un pH bajo puede hacer que la proteína A/G se escape de la columna y aparezca en la muestra eluida. Hay disponibles sistemas de tampón de elución suaves que emplean altas concentraciones de sal para evitar la exposición de los anticuerpos sensibles a un pH bajo. El costo también es una consideración importante con este método porque la proteína A/G inmovilizada es una resina más cara.
Para lograr la máxima pureza en un solo paso, se puede realizar una purificación por afinidad, utilizando el antígeno para proporcionar especificidad al anticuerpo. En este método, el antígeno utilizado para generar el anticuerpo se une covalentemente a un soporte de agarosa . Si el antígeno es un péptido , se sintetiza comúnmente con una cisteína terminal , que permite la unión selectiva a una proteína portadora, como KLH durante el desarrollo y para apoyar la purificación. A continuación, el medio que contiene el anticuerpo se incuba con el antígeno inmovilizado, ya sea en lotes o mientras el anticuerpo pasa a través de una columna, donde se une selectivamente y puede retenerse mientras se eliminan las impurezas. A continuación, se utiliza una elución con un tampón de pH bajo o un tampón de elución más suave y con alto contenido de sal para recuperar el anticuerpo purificado del soporte.
La heterogeneidad del producto es común en los anticuerpos monoclonales y otros productos biológicos recombinantes y generalmente se introduce antes durante la expresión o después durante la fabricación. [25] [26] [27]
Estas variantes son típicamente agregados, productos de desamidación , variantes de glicosilación , cadenas laterales de aminoácidos oxidados, así como adiciones de aminoácidos terminales de amino y carboxilo. [28] Estos cambios estructurales aparentemente minúsculos pueden afectar la estabilidad preclínica y la optimización del proceso, así como la potencia, biodisponibilidad e inmunogenicidad del producto terapéutico . El método de purificación generalmente aceptado de las corrientes de proceso para anticuerpos monoclonales incluye la captura del producto objetivo con proteína A , elución, acidificación para inactivar posibles virus mamíferos, seguida de cromatografía iónica , primero con perlas de aniones y luego con perlas de cationes. [ cita requerida ]
La cromatografía de desplazamiento se ha utilizado para identificar y caracterizar estas variantes, a menudo invisibles, en cantidades adecuadas para regímenes de evaluación preclínica posteriores, como estudios farmacocinéticos en animales . [29] [30] El conocimiento adquirido durante la fase de desarrollo preclínico es fundamental para una mejor comprensión de la calidad del producto y proporciona una base para la gestión de riesgos y una mayor flexibilidad regulatoria. La reciente iniciativa Quality by Design de la Administración de Alimentos y Medicamentos intenta proporcionar orientación sobre el desarrollo y facilitar el diseño de productos y procesos que maximicen la eficacia y el perfil de seguridad, al tiempo que mejoran la capacidad de fabricación del producto. [31]
La producción de anticuerpos monoclonales recombinantes implica la clonación de repertorio , CRISPR/Cas9 o tecnologías de visualización de fagos / visualización de levaduras . [32] La ingeniería de anticuerpos recombinantes implica la producción de anticuerpos mediante el uso de virus o levaduras , en lugar de ratones. Estas técnicas se basan en la clonación rápida de segmentos de genes de inmunoglobulina para crear bibliotecas de anticuerpos con secuencias de aminoácidos ligeramente diferentes de las que se pueden seleccionar anticuerpos con especificidades deseadas. [33] Las bibliotecas de anticuerpos de fagos son una variante de las bibliotecas de antígenos de fagos. [34] Estas técnicas se pueden utilizar para mejorar la especificidad con la que los anticuerpos reconocen los antígenos, su estabilidad en diversas condiciones ambientales, su eficacia terapéutica y su detectabilidad en aplicaciones de diagnóstico. [35] Las cámaras de fermentación se han utilizado para la producción de anticuerpos a gran escala.
Si bien los anticuerpos de ratón y humanos son estructuralmente similares, las diferencias entre ellos fueron suficientes para provocar una respuesta inmune cuando se inyectaron anticuerpos monoclonales murinos en humanos, lo que resultó en su rápida eliminación de la sangre, así como efectos inflamatorios sistémicos y la producción de anticuerpos humanos anti-ratón (HAMA).
Desde finales de los años 1980 se ha estudiado el ADN recombinante para aumentar los tiempos de residencia. En un enfoque denominado "injerto de CDR", [36] el ADN de ratón que codifica la porción de unión de un anticuerpo monoclonal se fusionó con ADN humano productor de anticuerpos en células vivas. La expresión de este ADN " quimérico " o "humanizado" a través de un cultivo celular produjo anticuerpos mitad ratón, mitad humanos. [37] [38]
Desde que se descubrió que era posible generar anticuerpos monoclonales, los científicos se han centrado en la creación de productos totalmente humanos para reducir los efectos secundarios de los anticuerpos humanizados o quiméricos. Se han propuesto varios enfoques exitosos: ratones transgénicos , [39] visualización de fagos [17] y clonación de células B individuales. [16]
Los anticuerpos monoclonales son más caros de fabricar que las moléculas pequeñas debido a los complejos procesos que implican y al tamaño general de las moléculas, además de los enormes costos de investigación y desarrollo que implica llevar una nueva entidad química a los pacientes. Su precio permite a los fabricantes recuperar los costos de inversión, que suelen ser elevados, y donde no hay controles de precios, como en los Estados Unidos, los precios pueden ser más altos si ofrecen un gran valor. Siete investigadores de la Universidad de Pittsburgh concluyeron que "el precio anual de las terapias con mAb es aproximadamente 100.000 dólares más alto en oncología y hematología que en otras enfermedades", comparándolos por paciente con los de los trastornos cardiovasculares o metabólicos, la inmunología, las enfermedades infecciosas, las alergias y la oftalmología. [40]
Una vez que se han producido anticuerpos monoclonales para una sustancia determinada, se pueden utilizar para detectar la presencia de dicha sustancia. Las proteínas se pueden detectar mediante pruebas de inmunotransferencia y de inmunotransferencia puntual . En inmunohistoquímica , los anticuerpos monoclonales se pueden utilizar para detectar antígenos en secciones de tejido fijadas y, de manera similar, se puede utilizar la inmunofluorescencia para detectar una sustancia en una sección de tejido congelado o en células vivas.
Los anticuerpos también se pueden utilizar para purificar sus compuestos objetivo a partir de mezclas, utilizando el método de inmunoprecipitación .
Los anticuerpos monoclonales terapéuticos actúan a través de múltiples mecanismos, como el bloqueo de funciones de moléculas específicas, la inducción de apoptosis en células que expresan el objetivo o la modulación de las vías de señalización. [41] [42] [43]
Un posible tratamiento para el cáncer implica anticuerpos monoclonales que se unen únicamente a antígenos específicos de las células cancerosas e inducen una respuesta inmunitaria contra la célula cancerosa diana. Estos mAb pueden modificarse para administrar una toxina , un radioisótopo , una citocina u otro conjugado activo o para diseñar anticuerpos biespecíficos que puedan unirse con sus regiones Fab tanto al antígeno diana como a un conjugado o célula efectora. Cada anticuerpo intacto puede unirse a receptores celulares u otras proteínas con su región Fc .
Los MAb aprobados por la FDA para el cáncer incluyen: [45]
Los anticuerpos monoclonales utilizados para enfermedades autoinmunes incluyen infliximab y adalimumab , que son eficaces en la artritis reumatoide , la enfermedad de Crohn , la colitis ulcerosa y la espondilitis anquilosante por su capacidad para unirse e inhibir el TNF-α . [46] Basiliximab y daclizumab inhiben la IL-2 en las células T activadas y, por lo tanto, ayudan a prevenir el rechazo agudo de los trasplantes de riñón. [46] Omalizumab inhibe la inmunoglobulina E humana (IgE) y es útil en el tratamiento del asma alérgica de moderada a grave .
Los anticuerpos monoclonales para aplicaciones de investigación se pueden encontrar directamente de los proveedores de anticuerpos o mediante el uso de un motor de búsqueda especializado como CiteAb . A continuación se muestran ejemplos de anticuerpos monoclonales clínicamente importantes.
En 2020, la Administración de Alimentos y Medicamentos de Estados Unidos autorizó el uso de emergencia de las terapias con anticuerpos monoclonales bamlanivimab/etesevimab y casirivimab/imdevimab para reducir el número de hospitalizaciones, visitas a salas de emergencia y muertes a causa de la COVID-19 . [48] [49] En septiembre de 2021, la administración Biden compró anticuerpos monoclonales de Regeneron por valor de 2900 millones de dólares a 2100 dólares por dosis para frenar la escasez. [51]
A diciembre de 2021, las pruebas de neutralización in vitro indican que las terapias con anticuerpos monoclonales (con excepción de sotrovimab y tixagevimab/cilgavimab ) probablemente no serían activas contra la variante Ómicron. [52]
Durante 2021-22, dos revisiones Cochrane no encontraron evidencia suficiente para el uso de anticuerpos monoclonales neutralizantes para tratar las infecciones por COVID-19. [53] [54] Las revisiones se aplicaron solo a personas que no estaban vacunadas contra la COVID-19 y solo a las variantes de la COVID-19 existentes durante los estudios, no a variantes más nuevas, como Omicron. [54]
En marzo de 2024, pemivibart , un fármaco de anticuerpos monoclonales, recibió una autorización de uso de emergencia de la FDA de EE. UU. para su uso como profilaxis previa a la exposición para proteger a ciertas personas inmunodeprimidas de moderadas a severas contra la COVID-19. [55] [56]
Varios anticuerpos monoclonales, como bevacizumab y cetuximab , pueden causar diferentes tipos de efectos secundarios. [57] Estos efectos secundarios se pueden clasificar en efectos secundarios comunes y graves. [58]
Algunos efectos secundarios comunes incluyen:
Entre los posibles efectos secundarios graves se encuentran: [59]
Este artículo incorpora texto de esta fuente, que se encuentra en el dominio público .Este artículo incorpora texto de esta fuente, que se encuentra en el dominio público .Este artículo incorpora texto de esta fuente, que se encuentra en el dominio público .
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