La cromatografía de desplazamiento es una técnica cromatográfica en la que se coloca una muestra en la cabeza de la columna [n 1] y luego se desplaza por un soluto que se absorbe con mayor fuerza que los componentes de la mezcla original. El resultado es que los componentes se resuelven en zonas "rectangulares" consecutivas de sustancias puras altamente concentradas en lugar de "picos" separados por disolventes. [1] Es principalmente una técnica preparativa; se puede obtener una mayor concentración de producto, mayor pureza y mayor rendimiento en comparación con otros modos de cromatografía.
El advenimiento de la cromatografía de desplazamiento se puede atribuir a Arne Tiselius , [2] quien en 1943 clasificó por primera vez los modos de cromatografía como frontal, elución y desplazamiento. La cromatografía de desplazamiento encontró una variedad de aplicaciones, incluido el aislamiento de elementos transuránicos [3] y entidades bioquímicas. [4] La técnica fue desarrollada nuevamente por Csaba Horváth , [5] quien empleó columnas y equipos modernos de alta presión. Desde entonces ha encontrado muchas aplicaciones, particularmente en el ámbito de la purificación de macromoléculas biológicas.
El principio básico de la cromatografía de desplazamiento es: solo hay un número finito de sitios de unión para solutos en la matriz (la fase estacionaria), y si un sitio está ocupado por una molécula, no está disponible para otras. Como en cualquier cromatografía, el equilibrio se establece entre moléculas de un tipo determinado unidas a la matriz y las del mismo tipo libres en solución. Debido a que el número de sitios de unión es finito, cuando la concentración de moléculas libres en solución es grande en relación con la constante de disociación para los sitios, esos sitios estarán casi llenos. Esto da como resultado una curvatura descendente en el gráfico de soluto unido vs. libre, en el caso más simple dando una isoterma de Langmuir . [n 2] Una molécula con una alta afinidad por la matriz (el desplazador) competirá más eficazmente por los sitios de unión, dejando la fase móvil enriquecida en el soluto de menor afinidad. El flujo de la fase móvil a través de la columna arrastra preferentemente el soluto de menor afinidad y, por lo tanto, en alta concentración, el soluto de mayor afinidad acabará desplazando todas las moléculas con menores afinidades.
Al comienzo de la operación, se aplica a la columna una mezcla de solutos que se van a separar, en condiciones seleccionadas para promover una alta retención. [n 3] Los solutos de mayor afinidad se retienen preferentemente cerca de la cabeza de la columna, mientras que los solutos de menor afinidad se desplazan más lejos corriente abajo. El componente que se desplaza más rápido comienza a formar una zona pura corriente abajo. Los demás componentes también comienzan a formar zonas, pero el suministro continuo de la alimentación mixta en la cabeza de la columna impide la resolución completa.
Una vez cargada toda la muestra, la alimentación se cambia al desplazador, elegido para que tenga una afinidad mayor que cualquier componente de la muestra. [n 4] El desplazador forma una zona de bordes afilados en la cabeza de la columna, empujando a los demás componentes aguas abajo. Cada componente de la muestra actúa ahora como desplazador para los solutos de menor afinidad, y los solutos se clasifican en una serie de bandas contiguas (un "tren de desplazamiento"), todas moviéndose aguas abajo a la velocidad establecida por el desplazador. El tamaño y la carga de la columna se eligen para permitir que este proceso de clasificación llegue a su finalización antes de que los componentes lleguen al fondo de la columna. Los solutos aparecen en el fondo de la columna como una serie de zonas contiguas, cada una de las cuales consta de un componente purificado, con una concentración dentro de cada zona individual efectivamente uniforme.
Una vez que se ha eluido el último soluto, es necesario retirar el desplazador de la columna. Dado que el desplazador se eligió por su alta afinidad, esto puede suponer un desafío. En el caso de los materiales de fase inversa, puede ser suficiente un lavado con un alto porcentaje de disolvente orgánico. También se suelen emplear grandes cambios de pH. Una estrategia eficaz es eliminar el desplazador mediante una reacción química; por ejemplo, si se utilizó un ion hidrógeno como desplazador, se puede eliminar mediante una reacción con hidróxido, o se puede eliminar un ion metálico polivalente mediante una reacción con un agente quelante. En algunas matrices, los grupos reactivos de la fase estacionaria se pueden titular para eliminar temporalmente los sitios de unión; por ejemplo, los intercambiadores de iones de ácido débil o las resinas quelantes se pueden convertir a la forma protonada. En el caso de los intercambiadores de iones de tipo gel, la inversión de la selectividad a una fuerza iónica muy alta también puede proporcionar una solución. A veces, el desplazador está diseñado específicamente con un grupo funcional titulable para cambiar su afinidad. Después de lavar el desplazador, la columna se lava según sea necesario para restaurarla a su estado inicial para la siguiente ejecución. [6] [7] [8]
En cualquier forma de cromatografía, la velocidad a la que el soluto se desplaza por la columna es un reflejo directo del porcentaje de tiempo que el soluto pasa en la fase móvil. Para lograr la separación, ya sea en la cromatografía de elución o de desplazamiento, deben existir diferencias apreciables en la afinidad de los respectivos solutos por la fase estacionaria. Ambos métodos se basan en el desplazamiento por la columna para amplificar el efecto de las pequeñas diferencias en la distribución entre las dos fases. La distribución entre las fases móvil y estacionaria se describe mediante la isoterma de unión, un gráfico del soluto unido a (o repartido en) la fase estacionaria en función de la concentración en la fase móvil. La isoterma suele ser lineal, o aproximadamente lineal, a bajas concentraciones, pero normalmente se curva (cóncava hacia abajo) a concentraciones más altas a medida que la fase estacionaria se satura.
En el modo de elución, los solutos se aplican a la columna como bandas estrechas y, a baja concentración, se desplazan por la columna como picos aproximadamente gaussianos . Estos picos continúan ensanchándose a medida que avanzan, en proporción a la raíz cuadrada de la distancia recorrida. Para que dos sustancias se resuelvan, deben migrar por la columna a velocidades suficientemente diferentes para superar los efectos de la dispersión de bandas. Operar a alta concentración, donde la isoterma es curva, es desventajoso en la cromatografía de elución porque la velocidad de desplazamiento depende de la concentración, lo que hace que los picos se dispersen y se distorsionen.
La retención en la cromatografía de elución se controla generalmente ajustando la composición de la fase móvil (en términos de composición del disolvente, pH, fuerza iónica, etc.) según el tipo de fase estacionaria empleada y los solutos particulares que se van a separar. Los componentes de la fase móvil generalmente tienen menor afinidad por la fase estacionaria que los solutos que se separan, pero están presentes en mayor concentración y logran sus efectos debido a la acción de masas . La resolución en la cromatografía de elución es generalmente mejor cuando los picos se retienen fuertemente, pero las condiciones que dan una buena resolución de los picos iniciales conducen a tiempos de ejecución prolongados y a un ensanchamiento excesivo de los picos posteriores a menos que se emplee la elución en gradiente . El equipo de gradiente agrega complejidad y gastos, particularmente a gran escala.
A diferencia de la cromatografía de elución, los solutos separados en el modo de desplazamiento forman zonas de bordes afilados en lugar de picos dispersos. Los límites de zona en la cromatografía de desplazamiento se agudizan por sí solos: si una molécula, por alguna razón, se adelanta a su banda, ingresa a una zona en la que se retiene con mayor fuerza y, luego, se desplazará más lentamente hasta que su zona la alcance. Además, debido a que la cromatografía de desplazamiento aprovecha la no linealidad de las isotermas, las cargas son deliberadamente altas; se puede separar más material en una columna dada, en un tiempo dado, y los componentes purificados se recuperan en concentraciones significativamente más altas. Las condiciones de retención aún se pueden ajustar, pero el desplazador controla la velocidad de migración de los solutos. El desplazador se selecciona para que tenga una mayor afinidad por la fase estacionaria que cualquiera de los solutos que se separan, y su concentración se establece para acercarse a la saturación de la fase estacionaria y para dar la velocidad de migración deseada de la onda de concentración. Se pueden emplear condiciones de alta retención sin operación de gradiente, porque el desplazador garantiza la eliminación de todos los solutos de interés en el tiempo de ejecución diseñado. [6] [7] [8]
Debido al efecto de concentración que produce la carga de la columna en condiciones de alta retención, la cromatografía de desplazamiento es muy adecuada para purificar componentes de corrientes de alimentación diluidas. Sin embargo, también es posible concentrar material de una corriente diluida en la cabeza de una columna cromatográfica y luego cambiar las condiciones para eluir el material adsorbido en modos isocráticos o de gradiente convencionales. Por lo tanto, este enfoque no es exclusivo de la cromatografía de desplazamiento, aunque la mayor capacidad de carga y la menor dilución permiten una mayor concentración en el modo de desplazamiento.
Una desventaja de la cromatografía de desplazamiento es que las no idealidades siempre dan lugar a una zona de superposición entre cada par de componentes; esta zona mixta debe recogerse por separado para reciclarla o descartarla para preservar la pureza de los materiales separados. La estrategia de añadir moléculas espaciadoras para formar zonas entre los componentes (a veces denominada "cromatografía de desplazamiento de portadores") se ha investigado [9] y puede ser útil cuando se encuentran espaciadores adecuados y fácilmente extraíbles. Otra desventaja es que el cromatograma en bruto, por ejemplo, un gráfico de absorbancia o índice de refracción frente al volumen de elución, puede ser difícil de interpretar para zonas contiguas, especialmente si el tren de desplazamiento no está completamente desarrollado. La documentación y la resolución de problemas pueden requerir un análisis químico adicional para establecer la distribución de un componente determinado. Otra desventaja es que el tiempo necesario para la regeneración limita el rendimiento.
Según el artículo de John C. Ford en la Enciclopedia de Cromatografía , los estudios teóricos indican que al menos para algunos sistemas, la cromatografía de elución sobrecargada optimizada ofrece un mayor rendimiento que la cromatografía de desplazamiento, aunque pruebas experimentales limitadas sugieren que la cromatografía de desplazamiento es superior (al menos antes de considerar el tiempo de regeneración). [7]
Históricamente, la cromatografía de desplazamiento se aplicó a las separaciones preparativas de aminoácidos y elementos de tierras raras y también se ha investigado para la separación de isótopos. [9] [10] [11] [12]
La purificación cromatográfica de proteínas a partir de mezclas complejas puede ser bastante complicada, en particular cuando las mezclas contienen proteínas retenidas de manera similar o cuando se desea enriquecer los componentes traza en la alimentación. Además, la carga de la columna suele ser limitada cuando se requieren resoluciones altas utilizando modos tradicionales de cromatografía (por ejemplo, cromatografía de gradiente lineal, cromatografía isocrática ). En estos casos, la cromatografía de desplazamiento es una técnica eficiente para la purificación de proteínas a partir de mezclas complejas con cargas altas de columna en una variedad de aplicaciones.
Un avance importante en el estado del arte de la cromatografía de desplazamiento fue el desarrollo de desplazadores de baja masa molecular para la purificación de proteínas en sistemas de intercambio iónico. [13] [14] [15] Esta investigación fue significativa porque representó un cambio importante respecto de la creencia convencional de que se requieren polímeros de polielectrolitos grandes para desplazar proteínas en sistemas de intercambio iónico.
Los desplazadores de baja masa molecular tienen ventajas operativas significativas en comparación con los grandes desplazadores de polielectrolitos. Por ejemplo, si hay alguna superposición entre el desplazador y la proteína de interés, estos materiales de baja masa molecular se pueden separar fácilmente de la proteína purificada durante el procesamiento posterior al desplazamiento utilizando métodos de purificación basados en el tamaño estándar (por ejemplo, cromatografía de exclusión por tamaño , ultrafiltración ). Además, el comportamiento de adsorción dependiente de la sal de estos desplazadores de bajo peso molecular facilita enormemente la regeneración de la columna. Estos desplazadores se han empleado para una amplia variedad de separaciones de alta resolución en sistemas de intercambio iónico. [16] [17] [18] [19] [20] [21] [22] Además, también se ha demostrado la utilidad de la cromatografía de desplazamiento para la purificación de factores de crecimiento recombinantes , [23] proteínas de vacunas antigénicas [24] y oligonucleótidos antisentido [25] . Hay varios ejemplos en los que se ha aplicado la cromatografía de desplazamiento a la purificación de proteínas mediante intercambio iónico , interacción hidrofóbica y cromatografía de fase inversa . [26]
La cromatografía de desplazamiento es muy adecuada para obtener cantidades de mg de proteínas purificadas a partir de mezclas complejas utilizando columnas de cromatografía analítica estándar a escala de laboratorio. También es particularmente adecuada para enriquecer componentes traza en la alimentación. La cromatografía de desplazamiento se puede llevar a cabo fácilmente utilizando una variedad de sistemas de resina, incluidos intercambio iónico, HIC y RPLC. [27]
La cromatografía bidimensional representa el enfoque más completo y riguroso para la evaluación del proteoma . Si bien los enfoques aceptados anteriormente han utilizado enfoques cromatográficos en modo de elución, como el intercambio de cationes para HPLC de fase inversa , los rendimientos suelen ser muy bajos y requieren sensibilidades analíticas en el rango picomolar a femtomolar. [28] Como la cromatografía de desplazamiento ofrece la ventaja de la concentración de componentes traza, la cromatografía bidimensional que utiliza el desplazamiento en lugar del modo de elución en el paso de cromatografía anterior representa una herramienta potencialmente poderosa para el análisis de componentes traza, modificaciones e identificación de componentes menores expresados del proteoma.