En síntesis química , la química de clic es una clase de reacciones simples de economía de átomos que se usan comúnmente para unir dos entidades moleculares de elección. La química click no es una única reacción específica, sino que describe una forma de generar productos que siguen ejemplos de la naturaleza , que también genera sustancias uniendo pequeñas unidades modulares. En muchas aplicaciones, las reacciones de clic unen una biomolécula y una molécula informadora . La química del clic no se limita a condiciones biológicas: el concepto de reacción de "clic" se ha utilizado en aplicaciones quimioproteómicas , farmacológicas, biomiméticas y de maquinaria molecular . [1] Sin embargo, se han vuelto notablemente útiles en la detección, localización y calificación de biomoléculas.
Las reacciones de clic ocurren en un recipiente , no son perturbadas por el agua , generan subproductos mínimos e inofensivos y están "impulsadas por resorte", caracterizadas por una alta fuerza impulsora termodinámica que las impulsa rápida e irreversiblemente a un alto rendimiento de un solo producto de reacción, con alta especificidad de reacción (en algunos casos, con regio y estereoespecificidad). Estas cualidades hacen que las reacciones de clic sean particularmente adecuadas para el problema de aislar y dirigir moléculas en entornos biológicos complejos. En tales entornos, los productos deben ser fisiológicamente estables y cualquier subproducto debe ser no tóxico (para sistemas in vivo ).
Al desarrollar reacciones bioortogonales específicas y controlables , los científicos han abierto la posibilidad de alcanzar objetivos particulares en lisados celulares complejos . Recientemente, los científicos han adaptado la química del clic para su uso en células vivas, por ejemplo utilizando sondas de moléculas pequeñas que encuentran y se unen a sus objetivos mediante reacciones de clic. A pesar de los desafíos de la permeabilidad celular, la bioortogonalidad, el etiquetado de fondo y la eficiencia de la reacción, las reacciones de clic ya han demostrado ser útiles en una nueva generación de experimentos desplegables (en los que se pueden aislar objetivos particulares utilizando, por ejemplo, moléculas informadoras que se unen a una determinada columna). y espectrometría de fluorescencia (en la que el fluoróforo se une a un objetivo de interés y el objetivo se cuantifica o localiza). Más recientemente, se han utilizado métodos novedosos para incorporar compañeros de reacción de clic en biomoléculas , incluida la incorporación de aminoácidos no naturales que contienen grupos reactivos en proteínas y la modificación de nucleótidos . Estas técnicas representan una parte del campo de la biología química , en el que la química de clic juega un papel fundamental al acoplar intencionada y específicamente unidades modulares a varios fines.
El término "química de clic" fue acuñado por la esposa de K. Barry Sharpless , Jan Dueser, [2] en 1998, y fue descrito completamente por primera vez por Sharpless, Hartmuth C. Kolb y MG Finn del Instituto de Investigación Scripps en 2001 . 3] [4] En 2022, el Premio Nobel de Química fue otorgado conjuntamente a Carolyn R. Bertozzi , Morten P. Meldal y K. Barry Sharpless , "por el desarrollo de la química del clic y la química bioortogonal ". [5]
La química click es un método para unir una sonda o sustrato de interés a una biomolécula específica, un proceso llamado bioconjugación . [6] La posibilidad de unir fluoróforos y otras moléculas informadoras ha hecho de la química click una herramienta muy poderosa para identificar, localizar y caracterizar biomoléculas nuevas y antiguas.
Uno de los primeros y más importantes métodos de bioconjugación fue expresar un indicador en el mismo marco de lectura abierto que una biomolécula de interés. En particular, la proteína verde fluorescente (GFP) se expresó por primera vez (y todavía se expresa) de esta manera en el extremo N o C de muchas proteínas. Sin embargo, este enfoque presenta varias dificultades. Por ejemplo, la GFP es una unidad muy grande y, a menudo, puede afectar el plegamiento de la proteína de interés. Además, al expresarse en cualquiera de los extremos, el aducto de GFP también puede afectar la orientación y expresión de la proteína deseada . Finalmente, utilizando este método, la GFP sólo puede unirse a proteínas, y no de forma postraduccional, dejando otras clases biomoleculares importantes ( ácidos nucleicos , lípidos , carbohidratos , etc.) fuera de su alcance.
Para superar estos desafíos, los químicos han optado por identificar pares de reacciones bioortogonales , permitiendo así el uso de pequeñas moléculas exógenas como sondas biomoleculares. Se puede unir un fluoróforo a una de estas sondas para dar una señal de fluorescencia al unirse la molécula indicadora al objetivo, tal como la GFP emite fluorescencia cuando se expresa con el objetivo.
Ahora surgen limitaciones de la química de la sonda con respecto a su objetivo. Para que esta técnica sea útil en sistemas biológicos, la química click debe ejecutarse en condiciones biológicas o cerca de ellas, producir pocos e (idealmente) subproductos no tóxicos, tener (preferiblemente) productos únicos y estables en las mismas condiciones y proceder rápidamente a Alto rendimiento en una sola maceta . Las reacciones existentes, como la ligadura de Staudinger y la cicloadición 1,3-dipolar de Huisgen , se han modificado y optimizado para tales condiciones de reacción. Hoy en día, la investigación en este campo no solo se refiere a comprender y desarrollar nuevas reacciones y reutilizar y recomprender reacciones conocidas, sino también a ampliar los métodos utilizados para incorporar socios de reacción en sistemas vivos, diseñar nuevos socios de reacción y desarrollar aplicaciones para la bioconjugación.
La empresa de biotecnología Shasqi es una empresa que aprovecha la química del clic en humanos. [7] [8]
Para que una reacción se considere una reacción de clic, debe cumplir ciertas características: [9]
El proceso preferiblemente:
Muchos de los criterios de la química del clic son subjetivos, e incluso si se pudieran acordar criterios objetivos y mensurables, es poco probable que una reacción sea perfecta para cada situación y aplicación. Sin embargo, se han identificado varias reacciones que se ajustan mejor al concepto que otras: [ se necesita aclaración ]
La clásica reacción de clic [17] [18] es la reacción catalizada por cobre de una azida con un alquino para formar un anillo heteroátomo de 5 miembros : una cicloadición azida-alquino catalizada por Cu (I) (CuAAC). La primera síntesis de triazol , a partir de dietil acetilendicarboxilato y fenil azida, fue reportada por Arthur Michael en 1893. [19] Posteriormente, a mediados del siglo XX, esta familia de cicloadiciones 1,3-dipolares tomó el nombre de Rolf Huisgen en honor a sus estudios de la cinética y condiciones de sus reacciones.
La catálisis con cobre(I) de la cicloadición 1,3-dipolar de Huisgen fue descubierta simultáneamente e independientemente por los grupos de Valery V. Fokin y K. Barry Sharpless en el Instituto de Investigación Scripps de California [20] y Morten Meldal en el Instituto Carlsberg . Laboratorio , Dinamarca. [21] La versión catalizada por cobre de esta reacción da solo el isómero 1,4, mientras que la cicloadición 1,3-dipolar no catalizada de Huisgen da los isómeros 1,4 y 1,5, es lenta y requiere una temperatura de 100 grados centígrados. [19]
Además, este "clic" catalizado por cobre no requiere ligandos sobre el metal, aunque se han informado y utilizado con éxito ligandos aceleradores como los ligandos de tris (triazolil) metil amina con varios sustituyentes en solución acuosa. [19] También se pueden utilizar otros ligandos como PPh3 y TBIA, aunque PPh 3 es propenso a la ligadura de Staudinger con el sustituyente azida. También se descubrió que Cu 2 O en agua a temperatura ambiente cataliza la misma reacción en 15 minutos con un rendimiento del 91%. [22]
El primer mecanismo de reacción propuesto incluyó un átomo de cobre catalítico; pero estudios isotópicos, cinéticos y de otro tipo han sugerido que un mecanismo dicopper puede ser más relevante. [23] [24] [25] [26] [27] Aunque esta reacción se desarrolla eficazmente en condiciones biológicas, el cobre en este rango de dosis es citotóxico. Se han presentado soluciones a este problema, como el uso de ligandos solubles en agua en el cobre para mejorar la penetración celular del catalizador y así reducir la dosis necesaria, [28] [29] [30] o usar ligandos quelantes para aumentar aún más la concentración efectiva de Cu(I) y, por tanto, disminuyendo la dosis real. [31] [32] [33]
Aunque Meldal y sus colaboradores informaron por primera vez de la variante catalizada por Cu (I) para la síntesis de peptidotriazoles sobre soporte sólido, sus condiciones estaban lejos del verdadero espíritu de la química click y fueron superadas por Sharpless, más reconocida públicamente. Meldal y sus compañeros de trabajo también optaron por no etiquetar este tipo de reacción como "química de clic", lo que supuestamente provocó que la sociedad química convencional pasara por alto su descubrimiento. Fokin y Sharpless lo describieron de forma independiente como un proceso catalítico confiable que ofrece "un nivel sin precedentes de selectividad, confiabilidad y alcance para aquellos esfuerzos de síntesis orgánica que dependen de la creación de enlaces covalentes entre diversos componentes básicos".
Los grupos Jia y Fokin informaron en 2005 de una reacción RuAAC análoga catalizada por rutenio, en lugar de cobre, que permite la producción selectiva de 1,5-isómeros. [34]
El grupo Bertozzi desarrolló aún más una de las reacciones de clic sin cobre de Huisgen para superar la citotoxicidad de la reacción CuAAC. [35] En lugar de utilizar Cu(I) para activar el alquino, el alquino se introduce en un difluorooctino tenso (DIFO), en el que los flúor gema propargílicos, aceptores de electrones, actúan junto con la tensión del anillo para desestabilizar en gran medida el alquino. [36] Esta desestabilización aumenta la fuerza impulsora de la reacción y el deseo del cicloalquino de aliviar la tensión del anillo.
Esta reacción se produce como una cicloadición concertada [3+2] al triple enlace de un ciclooctino en el mismo mecanismo que la cicloadición 1,3-dipolar de Huisgen. En el ciclooctino también se permiten sustituyentes distintos de los flúor, como los anillos de benceno.
Esta reacción se ha utilizado con éxito para buscar azidas en sistemas vivos, aunque la velocidad de reacción es algo más lenta que la del CuAAC. Además, debido a que la síntesis de ciclooctinas suele dar un rendimiento bajo, el desarrollo de sondas para esta reacción no ha sido tan rápido como para otras reacciones. Pero los derivados de ciclooctina como DIFO, dibencilciclooctina (DIBO) y biarilazaciclooctinona (BARAC) se han utilizado con éxito en la reacción SPAAC para buscar azidas en sistemas vivos. [37] [38] [39]
Los ciclooctinos filtrados con diarilo, incluido el dibencilciclooctino (DIBO), también se han utilizado para reaccionar con 1,3-nitronas en cicloadiciones de alquino-nitronas promovidas por deformación (SPANC) para producir isoxazolinas N-alquiladas. [40]
Debido a que esta reacción no contiene metales y se desarrolla con una cinética rápida (k2 tan rápido como 60 1/Ms, más rápido que CuAAC o SPAAC), SPANC se puede utilizar para el etiquetado de células vivas. Además, se tolera la sustitución de los átomos de carbono y nitrógeno del dipolo de nitrona y de las nitronas acíclicas y endocíclicas. Este gran margen proporciona mucha flexibilidad para la incorporación de sonda o mango de nitrona. [41]
Sin embargo, el producto isoxazolina no es tan estable como el producto triazol de CuAAC y SpAAC, y puede sufrir reordenamientos en condiciones biológicas. De todos modos, esta reacción sigue siendo muy útil ya que tiene una cinética de reacción notablemente rápida. [40]
Las aplicaciones de esta reacción incluyen el etiquetado de proteínas que contienen serina como primer residuo: la serina se oxida a aldehído con NaIO 4 y luego se convierte en nitrona con p-metoxibencenotiol, N-metilhidroxilamina y p-ansidina, y finalmente se incuba con ciclooctina para dar una haga clic en producto. El SPANC también permite el etiquetado multiplex. [42] [43]
Los alquenos tensos también utilizan el alivio de tensión como fuerza impulsora que permite su participación en reacciones de clic. Los transcicloalquenos (generalmente ciclooctenos) y otros alquenos tensos, como el oxanorbornadieno, reaccionan en reacciones de clic con varios socios, incluidos azidas, tetrazinas y tetrazoles. Estos compañeros de reacción pueden interactuar específicamente con el alqueno tenso, manteniéndose bioortogonales a los alquenos endógenos que se encuentran en lípidos, ácidos grasos, cofactores y otros productos naturales. [42]
El oxanorbornadieno (u otro alqueno activado) reacciona con azidas, dando triazoles como producto. Sin embargo, estos productos de triazoles no son aromáticos como lo son en las reacciones CuAAC o SPAAC y, como resultado, no son tan estables. El doble enlace activado en el oxanobornadieno produce un intermediario de triazolina que posteriormente sufre espontáneamente una reacción retro de Diels-aliso para liberar furano y dar 1,2,3- o 1,4,5-triazoles. Aunque esta reacción es lenta, es útil porque el oxabornodieno es relativamente sencillo de sintetizar. Sin embargo, la reacción no es enteramente quimioselectiva. [44]
Los ciclooctenos tensos y otros alquenos activados reaccionan con las tetrazinas en un Diels-Alder con demanda de electrones inversa seguido de una cicloadición retro [4+2] (ver figura). [45] Al igual que las otras reacciones del transcicloocteno, la liberación de tensión del anillo es una fuerza impulsora para esta reacción. Por lo tanto, los cicloalquenos de tres y cuatro miembros, debido a su alta tensión en el anillo, son sustratos de alqueno ideales. [45]
Al igual que otras cicloadiciones [4+2], los sustituyentes donadores de electrones en el dienófilo y los sustituyentes aceptores de electrones en el dieno aceleran el diels-aliso de demanda inversa. El dieno, la tetrazina, en virtud de tener nitrógenos adicionales, es un buen dieno para esta reacción. El dienófilo, el alqueno activado, a menudo puede unirse a grupos alquilo donadores de electrones en las moléculas objetivo, lo que hace que el dienófilo sea más adecuado para la reacción. [46]
La reacción de "fotoclic" tetrazol-alqueno es otra adición dipolar que Huisgen introdujo por primera vez a finales de la década de 1960 ChemBioChem 2007, 8, 1504. (68) Clovis, JS; Eckell, A.; Huisgen, R.; Sustmann, R. Chem. Ber. 1967, 100, 60.) Los tetrazoles con grupos amino o estirilo que pueden activarse mediante luz ultravioleta a 365 nm (365 no daña las células) reaccionan rápidamente (de modo que la luz ultravioleta no tiene que estar encendida durante mucho tiempo, generalmente alrededor de 1 a 4 minutos) para elaborar productos de pirazolina fluorogénica. Este esquema de reacción es muy adecuado para el etiquetado en células vivas, porque la luz ultravioleta a 365 nm daña las células mínimamente. Además, la reacción transcurre rápidamente, de modo que la luz ultravioleta puede administrarse durante períodos cortos. Los rendimientos cuánticos de la luz UV de longitud de onda corta pueden ser superiores a 0,5. Esto permite que los tetrazoles se utilicen selectivamente en longitud de onda en combinación con otra reacción de fotoligación, donde en la longitud de onda corta la reacción de ligación del tetrazol se produce casi exclusivamente y en la longitud de onda más larga se produce otra reacción (ligación mediante o-quinodimetanos) exclusivamente. [47] Finalmente, los reactivos no fluorogénicos dan lugar a un producto fluorogénico, equipando la reacción con un mango de espectrometría incorporado.
Tanto los tetrazoles como los grupos alquenos se han incorporado a las proteínas como aminoácidos no naturales, pero este beneficio no es único. En cambio, la fotoinducibilidad de la reacción la convierte en un candidato principal para la especificidad espaciotemporal en los sistemas vivos. Los desafíos incluyen la presencia de alquenos endógenos, aunque generalmente cis (como en los ácidos grasos), aún pueden reaccionar con el tetrazol activado. [48]
Click Chemistry es una poderosa herramienta para investigar la localización celular de moléculas pequeñas. Saber dónde van las moléculas pequeñas en la célula proporciona información valiosa sobre sus mecanismos de acción. [49] Este enfoque se ha utilizado en numerosos estudios, y los descubrimientos incluyen que la salinomicina se localiza en los lisosomas para iniciar la ferroptosis en las células madre cancerosas [50] y que los derivados de metformina se acumulan en las mitocondrias para quelar el cobre (II), lo que afecta el metabolismo y los cambios epigenéticos posteriores. en macrófagos inflamatorios. [51]
El potencial comercial de la química del clic es enorme. El fluoróforo rodamina se ha acoplado al norborneno y ha reaccionado con tetrazina en sistemas vivos. [52] En otros casos, SPAAC entre un fluoróforo modificado con ciclooctina y proteínas marcadas con azida permitió la selección de estas proteínas en lisados celulares. [53]
Los métodos para la incorporación de compañeros de reacción de clic en sistemas in y ex vivo contribuyen al alcance de posibles reacciones. El desarrollo de la incorporación de aminoácidos no naturales por parte de los ribosomas ha permitido la incorporación de compañeros de reacción de clic como grupos laterales no naturales en estos aminoácidos no naturales. Por ejemplo, una UAA con un grupo lateral azida proporciona un acceso conveniente para los cicloalquinos a las proteínas marcadas con este aminoácido no natural "AHA". [54] En otro ejemplo, "CpK" tiene un grupo lateral que incluye un ciclopropano alfa a un enlace amida que sirve como compañero de reacción de la tetrazina en una reacción inversa de diels-aliso. [55]
La síntesis de luciferina ejemplifica otra estrategia de aislamiento de compañeros de reacción, que consiste en aprovechar grupos naturales que aparecen raramente, como el 1,2-aminotiol, que aparece sólo cuando una cisteína es el aminoácido N' final en una proteína. Por tanto, su selectividad natural y bioortogonalidad relativa son valiosas para desarrollar sondas específicas para estas etiquetas. La reacción anterior ocurre entre un 1,2-aminotiol y un 2-cianobenzotiazol para producir luciferina, que es fluorescente. Esta fluorescencia de luciferina puede luego cuantificarse mediante espectrometría después de un lavado y usarse para determinar la presencia relativa de la molécula que contiene el 1,2-aminotiol. Si se desea la cuantificación de la proteína que no contiene 1,2-aminotiol, la proteína de interés se puede escindir para producir un fragmento con una N' Cys que sea vulnerable a la 2-CBT. [56]
Las aplicaciones adicionales incluyen:
En combinación con la química combinatoria , la detección de alto rendimiento y la creación de bibliotecas químicas , la química clic ha acelerado los descubrimientos de nuevos fármacos al hacer que cada reacción en una síntesis de varios pasos sea rápida, eficiente y predecible.
El Instituto de Investigación Scripps tiene una cartera de patentes de química de clics. [63] Los licenciatarios incluyen Invitrogen , [64] Allozyne , [65] Aileron, [66] Integrated Diagnostics, [67] y la empresa de biotecnología baseclick, [68] una escisión de BASF creada para vender productos elaborados con química click. [69] Además, baseclick posee una licencia exclusiva a nivel mundial para el mercado de investigación y diagnóstico en el campo de los ácidos nucleicos. Empresas como Cyandye también producen azidas y alquinos fluorescentes. [70]
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( ayuda )Agard, Nueva Jersey; Baskin, JM; Prescher, JA; Lo, A.; Bertozzi, CR (2006). "Un estudio comparativo de reacciones bioortogonales con azidas". Química ACS. Biol . 1 (10): 644–648. doi :10.1021/cb6003228. PMID 17175580.