El término química bioortogonal se refiere a cualquier reacción química que puede ocurrir dentro de los sistemas vivos sin interferir con los procesos bioquímicos nativos. [1] [2] [3] El término fue acuñado por Carolyn R. Bertozzi en 2003. [4] [5] Desde su introducción, el concepto de reacción bioortogonal ha permitido el estudio de biomoléculas como glicanos , proteínas , [ 6] y lípidos [7] en tiempo real en sistemas vivos sin toxicidad celular. Se han desarrollado varias estrategias de ligación química que cumplen con los requisitos de bioortogonalidad, incluida la cicloadición 1,3-dipolar entre azidas y ciclooctinas (también denominada química de clic sin cobre ), [8] entre nitronas y ciclooctinas, [9] oxima / formación de hidrazona a partir de aldehídos y cetonas , [10] la ligadura de tetrazina , [11] la reacción de clic basada en isocianuro , [12] y, más recientemente, la ligadura de cuatriciclano . [13]
El uso de la química bioortogonal normalmente se realiza en dos pasos. Primero, se modifica un sustrato celular con un grupo funcional bioortogonal (reportero químico) y se introduce en la célula; Los sustratos incluyen metabolitos , inhibidores de enzimas, etc. El reportero químico no debe alterar dramáticamente la estructura del sustrato para evitar afectar su bioactividad. En segundo lugar, se introduce una sonda que contiene el grupo funcional complementario para reaccionar y marcar el sustrato.
Aunque se han desarrollado reacciones bioortogonales efectivas, como la química de clic sin cobre , el desarrollo de nuevas reacciones continúa generando métodos ortogonales de etiquetado para permitir el uso de múltiples métodos de etiquetado en los mismos biosistemas. Carolyn R. Bertozzi recibió el Premio Nobel de Química en 2022 por su desarrollo de la química de clics y la química bioortogonal. [14]
La palabra bioortogonal proviene del griego bio- "vivo" y orthogōnios "en ángulo recto". Por lo tanto, literalmente, una reacción que va perpendicular a un sistema vivo, por lo que no lo perturba.
Para ser considerada bioortogonal, una reacción debe cumplir una serie de requisitos:
La ligadura de Staudinger es una reacción desarrollada por el grupo Bertozzi en el año 2000 que se basa en la clásica reacción de Staudinger de azidas con triarilfosfinas. [15] Inició el campo de la química bioortogonal como la primera reacción con grupos funcionales completamente abióticos, aunque ya no se utiliza tan ampliamente. La ligadura de Staudinger se ha utilizado tanto en células vivas como en ratones vivos. [5]
La azida puede actuar como un electrófilo blando que prefiere nucleófilos blandos como las fosfinas . Esto contrasta con la mayoría de los nucleófilos biológicos, que suelen ser nucleófilos duros. La reacción transcurre selectivamente en condiciones tolerantes al agua para producir un producto estable.
Las fosfinas están completamente ausentes en los sistemas vivos y no reducen los enlaces disulfuro a pesar de su leve potencial de reducción. Se ha demostrado que las azidas son biocompatibles en medicamentos aprobados por la FDA, como la azidotimidina, y en otros usos como reticulantes. Además, su pequeño tamaño les permite incorporarse fácilmente a biomoléculas a través de vías metabólicas celulares.
La fosfina nucleofílica ataca a la azida en el nitrógeno terminal electrófilo. A través de un estado de transición de cuatro miembros, N 2 se pierde para formar una aza-ilida. El iluro inestable se hidroliza para formar óxido de fosfina y una amina primaria. Sin embargo, esta reacción no es inmediatamente bioortogonal porque la hidrólisis rompe el enlace covalente en la azailida.
La reacción se modificó para incluir un grupo éster orto al átomo de fósforo en uno de los anillos de arilo para dirigir la azailida a través de una nueva ruta de reactividad con el fin de superar la hidrólisis inmediata colocando el éster para aumentar la concentración local. El ataque nucleofílico inicial a la azida es el paso limitante de la velocidad. El iluro reacciona con la trampa del éster electrófilo mediante ciclación intramolecular para formar un anillo de cinco miembros. Este anillo sufre hidrólisis para formar un enlace amida estable .
Los reactivos de fosfina se oxidan lentamente con el aire en los sistemas vivos. Además, es probable que sean metabolizados in vitro por enzimas del citocromo P450 .
La cinética de las reacciones es lenta con constantes de velocidad de segundo orden de alrededor de 0,0020 M −1 •s −1 . Los intentos de aumentar las tasas de ataque nucleofílico agregando grupos donadores de electrones a las fosfinas mejoraron la cinética, pero también aumentaron la tasa de oxidación del aire.
La mala cinética requiere el uso de altas concentraciones de fosfina, lo que conduce a problemas con una señal de fondo alta en aplicaciones de imágenes. Se han hecho intentos de combatir el problema del fondo alto mediante el desarrollo de reactivos de fosfina fluorogénicos basados en fluoresceína y luciferina , pero la cinética intrínseca sigue siendo una limitación. [dieciséis]
La química de clic sin cobre es una reacción bioortogonal desarrollada por primera vez por Carolyn Bertozzi como una variante activada de una cicloadición de alquino azida Huisgen , basada en el trabajo de Karl Barry Sharpless et al. A diferencia del CuAAC, la química del clic libre de Cu se ha modificado para que sea bioortogonal mediante la eliminación de un catalizador de cobre citotóxico, lo que permite que la reacción se desarrolle rápidamente y sin toxicidad para las células vivas. En lugar de cobre, la reacción es una cicloadición de alquino-azida promovida por deformación ( SPAAC ). Fue desarrollado como una alternativa más rápida a la ligadura de Staudinger, y las primeras generaciones reaccionaron sesenta veces más rápido. La bioortogonalidad de la reacción ha permitido aplicar la reacción de clic sin Cu en células cultivadas, peces cebra vivos y ratones.
La clásica cicloadición de azida-alquino catalizada por cobre ha sido una reacción de clic extremadamente rápida y efectiva para la bioconjugación, pero no es adecuada para su uso en células vivas debido a la toxicidad de los iones Cu (I). La toxicidad se debe al daño oxidativo de las especies reactivas de oxígeno formadas por los catalizadores de cobre. También se ha descubierto que los complejos de cobre inducen cambios en el metabolismo celular y son absorbidos por las células.
Ha habido cierto desarrollo de ligandos para prevenir daños a biomoléculas y facilitar la eliminación en aplicaciones in vitro . Sin embargo, se ha descubierto que diferentes entornos de ligandos de los complejos aún pueden afectar el metabolismo y la absorción, introduciendo una perturbación no deseada en la función celular. [17]
El grupo azida es particularmente bioortogonal porque es extremadamente pequeño (favorable para la permeabilidad celular y evita perturbaciones), metabólicamente estable y no existe naturalmente en las células y, por lo tanto, no tiene reacciones secundarias biológicas competitivas. Aunque las azidas no son el 1,3-dipolo más reactivo disponible para la reacción, se prefieren por su relativa falta de reacciones secundarias y estabilidad en condiciones sintéticas típicas. [18] El alquino no es tan pequeño, pero aún tiene la estabilidad y ortogonalidad necesarias para el etiquetado in vivo . Los ciclooctinos son tradicionalmente los cicloalquinos más comunes para estudios de etiquetado, ya que son el anillo alquino estable más pequeño.
La reacción se desarrolla como una cicloadición 1,3-dipolar estándar, un tipo de cambio pericíclico concertado y asincrónico . La naturaleza ambivalente del 1,3-dipolo debería hacer imposible la identificación de un centro electrofílico o nucleofílico en la azida, de modo que la dirección del flujo cíclico de electrones no tenga sentido. [p] Sin embargo, los cálculos han demostrado que la distribución de electrones entre los nitrógenos hace que el átomo de nitrógeno más interno tenga la mayor carga negativa. [19]
Aunque la reacción produce una mezcla regioisomérica de triazoles, la falta de regioselectividad en la reacción no es una preocupación importante para la mayoría de las aplicaciones actuales. Los requisitos más regioespecíficos y menos bioortogonales se satisfacen mejor con la cicloadición de Huisgen catalizada por cobre, especialmente dada la dificultad sintética (en comparación con la adición de un alquino terminal) de sintetizar una ciclooctina tensa.
OCT fue el primer ciclooctino desarrollado para la química de clic sin Cu. Si bien los alquinos lineales no reaccionan a temperaturas fisiológicas, la OCT pudo reaccionar fácilmente con azidas en condiciones biológicas sin mostrar toxicidad. Sin embargo, era poco soluble en agua y la cinética apenas mejoró con respecto a la ligadura de Staudinger. ALO (octino sin arilo) se desarrolló para mejorar la solubilidad en agua, pero aún tenía una cinética deficiente.
Las ciclooctinas monofluoradas ( MOFO ) y difluoradas ( DIFO ) se crearon para aumentar la velocidad mediante la adición de sustituyentes flúor aceptores de electrones en la posición propargílica . El flúor es un buen grupo aceptor de electrones en términos de accesibilidad sintética e inercia biológica. En particular, no puede formar un aceptor de Michael electrófilo que pueda reaccionar secundariamente con nucleófilos biológicos. [8] DIBO (dibenzociclooctina) se desarrolló como una fusión de dos anillos de arilo, lo que produce una tensión muy alta y una disminución de las energías de distorsión. Se propuso que la sustitución de biarilo aumenta la tensión del anillo y proporciona conjugación con el alquino para mejorar la reactividad. Aunque los cálculos han predicho que la sustitución monoarilo proporcionaría un equilibrio óptimo entre el choque estérico (con la molécula de azida) y la tensión, [20] se ha demostrado que los productos monoarilados son inestables.
A BARAC (biarilazaciclooctinona) le siguió la adición de un enlace amida que añade un centro tipo sp 2 para aumentar la velocidad por distorsión. La resonancia de amida contribuye a una tensión adicional sin crear insaturación adicional que conduciría a una molécula inestable. Además, la adición de un heteroátomo al anillo de ciclooctina mejora tanto la solubilidad como la farmacocinética de la molécula. BARAC tiene suficiente velocidad (y sensibilidad) hasta el punto de que no es necesario eliminar el exceso de sonda para reducir el fondo. Esto lo hace extremadamente útil en situaciones donde el lavado es imposible, como en imágenes en tiempo real o imágenes de animales completos. Aunque BARAC es extremadamente útil, su baja estabilidad requiere que se almacene a 0 °C, protegido de la luz y el oxígeno. [21]
Se realizaron variaciones de ajustes adicionales en BARAC para producir DIBAC/ADIBO para agregar tensión en el anillo distal y reducir los estéricos alrededor del alquino para aumentar aún más la reactividad. Keto-DIBO, en el que el grupo hidroxilo se ha convertido en una cetona, tiene una velocidad tres veces mayor debido a un cambio en la conformación del anillo. Los intentos de fabricar un difluorobenzociclooctino ( DIFBO ) no tuvieron éxito debido a la inestabilidad.
Los problemas con DIFO con estudios en ratones in vivo ilustran la dificultad de producir reacciones bioortogonales. Aunque DIFO fue extremadamente reactivo en el etiquetado de células, tuvo un desempeño deficiente en estudios con ratones debido a su unión con la albúmina sérica . La hidrofobicidad de la ciclooctina promueve el secuestro por membranas y proteínas séricas, lo que reduce las concentraciones biodisponibles. En respuesta, se desarrolló DIMAC (dimetoxiazaciclooctina) para aumentar la solubilidad en agua, la polaridad y la farmacocinética, [22] aunque los esfuerzos en el etiquetado bioortogonal de modelos de ratón aún están en desarrollo.
Los esfuerzos computacionales han sido vitales para explicar la termodinámica y la cinética de estas reacciones de cicloadición, lo que ha jugado un papel vital para continuar mejorando la reacción. Hay dos métodos para activar alquinos sin sacrificar la estabilidad: disminuir la energía del estado de transición o disminuir la estabilidad del reactivo.
Disminución de la estabilidad del reactivo: Houk [23] ha propuesto que las diferencias en la energía (E d ‡ ) requerida para distorsionar la azida y el alquino en las geometrías del estado de transición controlan las alturas de la barrera para la reacción. La energía de activación (E ‡ ) es la suma de distorsiones desestabilizadoras e interacciones estabilizadoras (E i ‡ ). La distorsión más significativa se encuentra en el grupo funcional azida con menor contribución de distorsión alquino. Sin embargo, sólo la ciclooctina puede modificarse fácilmente para lograr una mayor reactividad. Las barreras de reacción calculadas para fenil azida y acetileno (16,2 kcal/mol) frente a ciclooctina (8,0 kcal/mol) dan como resultado un aumento de velocidad previsto de 10 6 . La ciclooctina requiere menos energía de distorsión (1,4 kcal/mol frente a 4,6 kcal/mol), lo que da como resultado una energía de activación más baja a pesar de una energía de interacción más pequeña.
Disminución de la energía del estado de transición: los grupos aceptores de electrones, como el flúor, aumentan la tasa al disminuir la energía LUMO y la brecha HOMO-LUMO. Esto conduce a una mayor transferencia de carga de la azida al ciclooctino fluorado en el estado de transición, aumentando la energía de interacción (valor negativo más bajo) y la energía de activación general. [24] La disminución del LUMO es el resultado de la hiperconjugación entre los orbitales donantes π de alquino y los aceptores σ* de CF. Estas interacciones proporcionan estabilización principalmente en el estado de transición como resultado del aumento de las capacidades donador/aceptor de los enlaces a medida que se distorsionan. Los cálculos de NBO han demostrado que la distorsión del estado de transición aumenta la energía de interacción en 2,8 kcal/mol.
La hiperconjugación entre enlaces π fuera del plano es mayor porque los enlaces π en el plano están mal alineados. Sin embargo, la flexión del estado de transición permite que los enlaces π en el plano tengan una disposición más antiperiplanar que facilita la interacción. Se logra una estabilización adicional de la energía de la interacción hiperconjugativa mediante un aumento en la población electrónica de σ* debido a la formación del enlace CN. La hiperconjugación negativa con los enlaces σ* CF mejora esta interacción estabilizadora. [19]
Aunque la regioselectividad no es un gran problema en las aplicaciones actuales de imágenes de la química click sin cobre, es un problema que impide aplicaciones futuras en campos como el diseño de fármacos o la peptidomimética. [25]
Actualmente la mayoría de los ciclooctinos reaccionan para formar mezclas regioisoméricas. [m] El análisis computacional ha encontrado que, si bien se calcula que la regioselectividad de la fase gaseosa favorece la adición de 1,5 sobre la adición de 1,4 en hasta 2,9 kcal/mol en energía de activación, las correcciones de solvatación dan como resultado las mismas barreras de energía para ambos regioisómeros. Si bien el isómero 1,4 en la cicloadición de DIFO se ve desfavorecido por su mayor momento dipolar, la solvatación lo estabiliza más fuertemente que el isómero 1,5, erosionando la regioselectividad. [24]
Las ciclooctinas simétricas como BCN (biciclo[6.1.0]nonino) forman un regioisómero único tras la cicloadición [26] y pueden servir para abordar este problema en el futuro.
La aplicación más extendida de la química click sin cobre es la obtención de imágenes biológicas en células vivas o animales utilizando una biomolécula marcada con azida y una ciclooctina que lleva un agente de imágenes.
Las variantes fluorescentes de ceto y oxima de DIBO se utilizan en reacciones de clic de interruptor de fluoro en las que la fluorescencia del ciclooctino es apagada por el triazol que se forma en la reacción. [27] Por otro lado, los ciclooctinos conjugados con cumarina , como coumBARAC , se han desarrollado de manera que el alquino suprime la fluorescencia mientras que la formación de triazol aumenta diez veces el rendimiento cuántico de fluorescencia. [28]
Se ha investigado el control espacial y temporal del etiquetado del sustrato utilizando ciclooctinos fotoactivables. Esto permite el equilibrio del alquino antes de la reacción para reducir los artefactos como resultado de los gradientes de concentración. Los ciclooctinos enmascarados no pueden reaccionar con azidas en la oscuridad, pero se convierten en alquinos reactivos al ser irradiados con luz. [29]
Se está explorando la química de clic sin cobre para su uso en la síntesis de agentes de imágenes de PET que deben prepararse rápidamente con alta pureza y rendimiento para minimizar la descomposición isotópica antes de que se puedan administrar los compuestos. Tanto las constantes de alta velocidad como la bioortogonalidad de SPAAC son susceptibles a la química del PET. [30]
La química click sin cobre se ha adaptado para utilizar nitronas como 1,3-dipolo en lugar de azidas y se ha utilizado en la modificación de péptidos. [9]
Esta cicloadición entre una nitrona y una ciclooctina forma isoxazolinas N-alquiladas. La velocidad de reacción se ve reforzada por el agua y es extremadamente rápida con constantes de velocidad de segundo orden que varían de 12 a 32 M −1 •s −1 , dependiendo de la sustitución de la nitrona. Aunque la reacción es extremadamente rápida, enfrenta problemas a la hora de incorporar la nitrona a las biomoléculas mediante el marcaje metabólico. El etiquetado sólo se ha logrado mediante la modificación postraduccional de péptidos.
Las cicloadiciones 1,3 dipolares se han desarrollado como una reacción bioortogonal utilizando un óxido de nitrilo como 1,3-dipolo y un norborneno como dipolarófilo. Su uso principal ha sido el etiquetado de ADN y ARN en sintetizadores automatizados de oligonucleótidos [31] y el entrecruzamiento de polímeros en presencia de células vivas. [32]
Los norbornenos fueron seleccionados como dipolarófilos debido a su equilibrio entre la reactividad y la estabilidad promovidas por la deformación. Los inconvenientes de esta reacción incluyen la reactividad cruzada del óxido de nitrilo debido a la fuerte electrofilia y la cinética de reacción lenta.
La cicloadición de oxanorbornadieno es una cicloadición 1,3-dipolar seguida de una reacción retro- Diels Alder para generar un conjugado unido a triazol con la eliminación de una molécula de furano . [33] El trabajo preliminar ha establecido su utilidad en experimentos de etiquetado de péptidos y también se ha utilizado en la generación de compuestos de imágenes SPECT . [34] Más recientemente, se describió el uso de un oxanorbornadieno en una reacción "iClick" a temperatura ambiente sin catalizador, en la que un aminoácido modelo está unido al resto metálico, en un enfoque novedoso para las reacciones bioortogonales. [35]
La tensión del anillo y la deficiencia de electrones en el oxanorbornadieno aumentan la reactividad hacia el paso limitante de la velocidad de cicloadición. La reacción retro-Diels Alder ocurre rápidamente después para formar el estable 1,2,3 triazol. Los problemas incluyen una mala tolerancia a los sustituyentes que pueden cambiar la electrónica del oxanorbornadieno y tasas bajas (constantes de velocidad de segundo orden del orden de 10 −4 ).
La ligación de tetrazina es la reacción de un trans-cicloocteno y una s- tetrazina en una reacción de Diels Alder de demanda inversa seguida de una reacción retro-Diels Alder para eliminar el gas nitrógeno. [36] La reacción es extremadamente rápida con una constante de velocidad de segundo orden de 2000 M −1 –s −1 (en 9:1 metanol/agua), lo que permite modificaciones de biomoléculas en concentraciones extremadamente bajas.
Según el trabajo computacional de Bach, la energía de deformación de los Z-ciclooctenos es de 7,0 kcal/mol en comparación con las 12,4 kcal/mol del ciclooctano debido a la pérdida de dos interacciones transanulares. El E-cicloocteno tiene un doble enlace muy retorcido que da como resultado una energía de deformación de 17,9 kcal/mol. [37] Como tal, el transcicloocteno altamente tenso se utiliza como dienófilo reactivo . El dieno es una 3,6-diaril-s-tetrazina que ha sido sustituida para resistir la reacción inmediata con el agua. La reacción transcurre mediante una cicloadición inicial seguida de una Diels Alder inversa para eliminar el N2 y evitar la reversibilidad de la reacción. [11]
La reacción no sólo es tolerante al agua, sino que se ha descubierto que la velocidad aumenta en medios acuosos. También se han realizado reacciones utilizando norbornenos como dienófilos a velocidades de segundo orden del orden de 1 M −1 •s −1 en medios acuosos. La reacción se ha aplicado en el etiquetado de células vivas [38] y en el acoplamiento de polímeros. [39]
Esta reacción de clic de isocianuro es una cicloadición [4+1] seguida de una eliminación retro-Diels Alder de N2 . [12]
La reacción procede con una cicloadición inicial [4+1] seguida de una reversión para eliminar un sumidero termodinámico y evitar la reversibilidad. Este producto es estable si se utiliza una amina terciaria o isocianopropanoato. Si se utiliza un isocianuro secundario o primario, el producto formará una imina que se hidroliza rápidamente.
El isocianuro es un indicador químico favorito debido a su pequeño tamaño, estabilidad, no toxicidad y ausencia en los sistemas de mamíferos. Sin embargo, la reacción es lenta, con constantes de velocidad de segundo orden del orden de 10 −2 M −1 •s −1 .
La química del fotoclic utiliza una cicloeliminación fotoinducida para liberar N 2 . Esto genera un intermedio de 1,3 nitrilo imina de vida corta mediante la pérdida de gas nitrógeno, que sufre una cicloadición 1,3-dipolar con un alqueno para generar cicloaductos de pirazolina. [12]
La fotoinducción se lleva a cabo con una breve exposición a la luz (la longitud de onda depende del tetrazol) para minimizar el fotodaño a las células. La reacción se mejora en condiciones acuosas y genera un único regioisómero.
La nitrilo imina transitoria es altamente reactiva para la cicloadición 1,3-dipolar debido a una estructura curvada que reduce la energía de distorsión. La sustitución con grupos donadores de electrones en los anillos de fenilo aumenta la energía del HOMO cuando se coloca en la 1,3 nitrilo imina y aumenta la velocidad de reacción.
Las ventajas de este enfoque incluyen la capacidad de controlar espacial o temporalmente la reacción y la capacidad de incorporar tanto alquenos como tetrazoles en biomoléculas utilizando métodos biológicos simples como la codificación genética. [40] Además, el tetrazol se puede diseñar para que sea fluorogénico con el fin de controlar el progreso de la reacción. [41]
La ligadura de cuadriciclano utiliza un cuadriciclano altamente tenso para someterse a una cicloadición [2+2+2] con sistemas π. [13]
El cuadriciclano es abiótico, no reacciona con las biomoléculas (debido a la saturación completa), relativamente pequeño y muy tenso (~80 kcal/mol). Sin embargo, es muy estable a temperatura ambiente y en condiciones acuosas a pH fisiológico. Es capaz de reaccionar selectivamente con sistemas π pobres en electrones, pero no con alquenos, alquinos o ciclooctinos simples.
Se eligió bis(ditiobencil)níquel(II) como compañero de reacción de una selección de candidatos basada en la reactividad. Para evitar la reversión a norbornadieno inducida por la luz, se añade dietilditiocarbamato para quelar el níquel en el producto.
Estas reacciones se ven reforzadas por condiciones acuosas con una constante de velocidad de segundo orden de 0,25 M −1 •s −1 . De particular interés es que se ha demostrado que es bioortogonal tanto para la formación de oxima como para la química de clic sin cobre.
La química bioortogonal es una herramienta atractiva para la orientación previa de experimentos en imágenes nucleares y radioterapia . [42]