Una vacuna de ADN es un tipo de vacuna que transfecta una secuencia de ADN que codifica un antígeno específico en las células de un organismo como mecanismo para inducir una respuesta inmune. [1] [2]
Las vacunas de ADN funcionan inyectando un plásmido modificado genéticamente que contiene la secuencia de ADN que codifica el antígeno o los antígenos contra los cuales se busca una respuesta inmune, de modo que las células producen directamente el antígeno, provocando así una respuesta inmunológica protectora . [3] Las vacunas de ADN tienen ventajas teóricas sobre las vacunas convencionales, incluida la "capacidad de inducir una gama más amplia de tipos de respuesta inmune". [4] Se han probado varias vacunas de ADN para uso veterinario . [3] En algunos casos, se ha obtenido protección contra enfermedades en los animales, en otros no. [3] Se están realizando investigaciones sobre el tratamiento de las enfermedades virales, bacterianas y parasitarias en humanos, así como del cáncer. [4] En agosto de 2021, las autoridades indias dieron aprobación de emergencia al ZyCoV-D . Desarrollada por Cadila Healthcare , es la primera vacuna de ADN aprobada para humanos. [5]
Las vacunas convencionales contienen antígenos específicos de un patógeno o virus atenuados que estimulan una respuesta inmune en el organismo vacunado. Las vacunas de ADN son miembros de las vacunas genéticas , porque contienen una información genética (ADN o ARN) que codifica la producción celular ( biosíntesis de proteínas ) de un antígeno . Las vacunas de ADN contienen ADN que codifica antígenos específicos de un patógeno. El ADN se inyecta en el cuerpo y es absorbido por las células, cuyos procesos metabólicos normales sintetizan proteínas basándose en el código genético del plásmido que han absorbido. Debido a que estas proteínas contienen regiones de secuencias de aminoácidos que son características de bacterias o virus, se reconocen como extrañas y cuando las células huésped las procesan y se muestran en su superficie, se alerta al sistema inmunológico, que luego desencadena respuestas inmunes. [6] [7] Alternativamente, el ADN puede encapsularse en una proteína para facilitar la entrada a la célula. Si esta proteína de la cápside se incluye en el ADN, la vacuna resultante puede combinar la potencia de una vacuna viva sin riesgos de reversión. [ cita necesaria ]
En 1983, Enzo Paoletti y Dennis Panicali, del Departamento de Salud de Nueva York, idearon una estrategia para producir vacunas de ADN recombinante mediante el uso de ingeniería genética para transformar la vacuna común contra la viruela en vacunas que pudieran prevenir otras enfermedades. [8] Alteraron el ADN del virus de la viruela vacuna insertando un gen de otros virus (a saber, el virus del herpes simple , la hepatitis B y la influenza ). [9] [10] En 1993, Jeffrey Ulmer y sus compañeros de trabajo en Merck Research Laboratories demostraron que la inyección directa de ratones con ADN plasmídico que codifica un antígeno de la gripe protegía a los animales contra la infección experimental posterior con el virus de la gripe. [11] En 2016, una vacuna de ADN para el virus Zika comenzó a probarse en humanos en los Institutos Nacionales de Salud . Se planeó que el estudio involucrara a hasta 120 sujetos de entre 18 y 35 años. Por separado, Inovio Pharmaceuticals y GeneOne Life Science comenzaron las pruebas de una vacuna de ADN diferente contra el Zika en Miami. La vacuna NIH se inyecta en la parte superior del brazo a alta presión. La fabricación de las vacunas en volumen seguía sin resolverse en agosto de 2016. [12] Se están llevando a cabo ensayos clínicos de vacunas de ADN para prevenir el VIH. [13]
En agosto de 2021, las autoridades indias dieron aprobación de emergencia al ZyCoV-D. Desarrollada por Cadila Healthcare , es la primera vacuna de ADN contra la COVID-19 . [5]
Hasta 2021, [actualizar]no se han aprobado vacunas de ADN para uso humano en los Estados Unidos. Pocos ensayos experimentales han provocado una respuesta lo suficientemente fuerte como para proteger contra enfermedades y la utilidad de la técnica aún no se ha demostrado en humanos.
Se aprobó una vacuna veterinaria de ADN para proteger a los caballos del virus del Nilo Occidental. [14] Otra vacuna contra el virus del Nilo Occidental se ha probado con éxito en petirrojos americanos. [15]
También se está investigando la inmunización con ADN como medio para desarrollar sueros antiveneno. [1] La inmunización con ADN se puede utilizar como plataforma tecnológica para la inducción de anticuerpos monoclonales. [2]
Las vacunas de ADN provocan la mejor respuesta inmune cuando se utilizan vectores de alta expresión. Estos son plásmidos que generalmente constan de un fuerte promotor viral para impulsar la transcripción y traducción in vivo del gen (o ADN complementario ) de interés. [18] A veces se puede incluir el intrón A para mejorar la estabilidad del ARNm y, por lo tanto, aumentar la expresión de proteínas. [19] Los plásmidos también incluyen una fuerte señal de poliadenilación /terminación transcripcional , como secuencias de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina o de betaglobulina de conejo . [6] [7] [20] Los vectores policistrónicos (con múltiples genes de interés) a veces se construyen para expresar más de un inmunógeno o para expresar un inmunógeno y una proteína inmunoestimuladora. [21]
Debido a que el plásmido, que transporta un código genético relativamente pequeño de hasta aproximadamente 200 K pb , es el "vehículo" a partir del cual se expresa el inmunógeno, es esencial optimizar el diseño del vector para lograr la máxima expresión de proteínas. [21] Una forma de mejorar la expresión de proteínas es optimizando el uso de codones de ARNm patógenos para células eucariotas . Los patógenos a menudo tienen contenidos de AT diferentes a los de las especies diana, por lo que alterar la secuencia genética del inmunógeno para reflejar los codones más comúnmente utilizados en la especie diana puede mejorar su expresión. [22]
Otra consideración es la elección del promotor . El promotor SV40 se utilizó convencionalmente hasta que la investigación demostró que los vectores impulsados por el promotor del virus del sarcoma de Rous (RSV) tenían tasas de expresión mucho más altas. [6] Más recientemente, la expresión y la inmunogenicidad se han incrementado aún más en sistemas modelo mediante el uso del promotor temprano inmediato del citomegalovirus (CMV) y un elemento transcripcional retroviral que actúa en cis . [23] Las modificaciones adicionales para mejorar las tasas de expresión incluyen la inserción de secuencias potenciadoras, intrones sintéticos , secuencias líderes tripartitas (TPL) de adenovirus y modificaciones a las secuencias de poliadenilación y terminación transcripcional. [6] Un ejemplo de plásmido de vacuna de ADN es pVAC, que utiliza el promotor SV40 .
Los fenómenos de inestabilidad estructural son de especial preocupación para la fabricación de plásmidos, la vacunación con ADN y la terapia génica. [24] Las regiones accesorias pertenecientes a la columna vertebral del plásmido pueden participar en una amplia gama de fenómenos de inestabilidad estructural. Los catalizadores de inestabilidad genética bien conocidos incluyen repeticiones directas, invertidas y en tándem, que son evidentes en muchos vectores de expresión y clonación disponibles comercialmente. Por lo tanto, la reducción o eliminación completa de secuencias principales no codificantes extrañas reduciría significativamente la propensión a que se produzcan tales eventos y, en consecuencia, el potencial recombinógeno general del plásmido. [25]
Una vez que el plásmido se inserta en el núcleo de la célula transfectada, codifica una cadena peptídica de un antígeno extraño. En su superficie, la célula muestra el antígeno extraño con moléculas del complejo de histocompatibilidad (MHC) de clase I y de clase II. Luego, la célula presentadora de antígeno viaja a los ganglios linfáticos y presenta el péptido antigénico y la molécula coestimuladora que envía señales a las células T, iniciando la respuesta inmune. [26]
Los inmunógenos pueden dirigirse a varios compartimentos celulares para mejorar las respuestas de anticuerpos o células T citotóxicas. Los antígenos secretados o unidos a la membrana plasmática son más eficaces para inducir respuestas de anticuerpos que los antígenos citosólicos , mientras que las respuestas de las células T citotóxicas pueden mejorarse dirigiéndose a los antígenos para la degradación citoplasmática y la posterior entrada en la vía del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) de clase I. [7] Esto generalmente se logra mediante la adición de señales de ubiquitina N-terminal . [27] [28] [29]
La conformación de la proteína también puede afectar las respuestas de los anticuerpos. Las estructuras "ordenadas" (como las partículas virales) son más efectivas que las estructuras desordenadas. [30] Cadenas de minigenes (o epítopos MHC clase I ) de diferentes patógenos generan respuestas citotóxicas de células T a algunos patógenos, especialmente si también se incluye un epítopo TH. [7]
Las vacunas de ADN se han introducido en tejidos animales mediante múltiples métodos. En 1999, los dos enfoques más populares eran la inyección de ADN en solución salina : mediante el uso de una aguja hipodérmica estándar o mediante el uso de una pistola genética . [31] Varias otras técnicas han sido documentadas en los años intermedios.
La inyección de solución salina normalmente se realiza por vía intramuscular (IM) en el músculo esquelético o por vía intradérmica (ID), entregando ADN a los espacios extracelulares. Esto puede ser asistido 1) por electroporación ; [32] 2) dañando temporalmente las fibras musculares con miotoxinas como la bupivacaína ; o 3) mediante el uso de soluciones hipertónicas de solución salina o sacarosa . [6] Las respuestas inmunes a este método pueden verse afectadas por factores que incluyen el tipo de aguja, [16] la alineación de la aguja, la velocidad de inyección, el volumen de inyección, el tipo de músculo y la edad, el sexo y la condición fisiológica del receptor. [6]
La entrega de una pistola genética acelera balísticamente el ADN plasmídico (pDNA) que ha sido absorbido en micropartículas de oro o tungsteno en las células objetivo, utilizando helio comprimido como acelerador. [6] [21]
Las alternativas incluían la instilación en aerosol de ADN desnudo en superficies mucosas , como la mucosa nasal y pulmonar , [21] y la administración tópica de ADNp en los ojos [33] y la mucosa vaginal. [21] La administración a la superficie de la mucosa también se ha logrado utilizando preparaciones de ADN con liposomas catiónicos, [7] microesferas biodegradables , [34] [21] vectores atenuados de Salmonalla , [35] Shigella o Listeria para administración oral a la mucosa intestinal [36] y vectores de adenovirus recombinantes. [21]
Para la administración de vacunas de ADN se ha empleado un vehículo híbrido compuesto de células bacterianas y polímeros sintéticos. Un núcleo interno de E. coli y una capa externa de poli(beta-aminoéster) funcionan sinérgicamente para aumentar la eficiencia al abordar las barreras asociadas con la administración de genes de células presentadoras de antígenos , que incluyen la captación e internalización celular, el escape fagosómico y la concentración de carga intracelular. [ jerga ] Probado en ratones, se descubrió que el vector híbrido induce una respuesta inmune. [37] [38]
Otro enfoque para la vacunación con ADN es la inmunización con biblioteca de expresión (ELI). Con esta técnica, potencialmente se pueden administrar todos los genes de un patógeno al mismo tiempo, lo que puede resultar útil para patógenos que son difíciles de atenuar o cultivar. [6] ELI se puede utilizar para identificar qué genes inducen una respuesta protectora. Esto se ha probado con Mycoplasma pulmonis , un patógeno pulmonar murino con un genoma relativamente pequeño . Incluso las bibliotecas de expresión parcial pueden inducir protección contra un desafío posterior. [39]
El método de administración determina la dosis necesaria para generar una respuesta inmunitaria eficaz. Las inyecciones de solución salina requieren cantidades variables de ADN, de 10 μg a 1 mg, mientras que las entregas de armas genéticas requieren de 100 a 1000 veces menos. [40] Generalmente, se requieren entre 0,2 μg y 20 μg, aunque se han informado cantidades tan bajas como 16 ng. [6] Estas cantidades varían según la especie. Los ratones, por ejemplo, requieren aproximadamente 10 veces menos ADN que los primates . [7] Las inyecciones de solución salina requieren más ADN porque el ADN se entrega a los espacios extracelulares del tejido objetivo (normalmente músculo), donde tiene que superar barreras físicas (como la lámina basal y grandes cantidades de tejido conectivo ) antes de administrarse. las células, mientras que las entregas de armas genéticas impulsan/forzan el ADN directamente hacia las células, lo que resulta en menos "desperdicio". [6] [7]
La inmunización con ADN puede generar múltiples respuestas TH, incluida la linfoproliferación y la generación de una variedad de perfiles de citocinas . Una ventaja importante de las vacunas de ADN es la facilidad con la que pueden manipularse para sesgar el tipo de ayuda de células T hacia una respuesta TH1 o TH2. [41] Cada tipo tiene patrones distintivos de expresión de linfocinas y quimiocinas, tipos específicos de inmunoglobulinas , patrones de tráfico de linfocitos y tipos de respuestas inmunes innatas .
El tipo de ayuda de células T generada está influenciado por el método de administración y el tipo de inmunógeno expresado, así como por la orientación a diferentes compartimentos linfoides. [6] [42] Generalmente, las inyecciones con aguja de solución salina (ya sea IM o ID) tienden a inducir respuestas TH1, mientras que la administración de pistola genética aumenta las respuestas TH2. [41] [42] Esto es cierto para los antígenos intracelulares y unidos a la membrana plasmática, pero no para los antígenos secretados, que parecen generar respuestas TH2, independientemente del método de administración. [43]
En general, el tipo de ayuda de células T que se genera es estable a lo largo del tiempo y no cambia cuando se estimula o después de inmunizaciones posteriores que normalmente habrían provocado el tipo opuesto de respuesta en una muestra sin tratamiento previo. [41] [42] Sin embargo, Mor et al. . (1995) [18] inmunizaron y reforzaron ratones con pDNA que codifica la proteína circumsporozoito del parásito de la malaria del ratón Plasmodium yoelii (PyCSP) y encontraron que la respuesta inicial TH2 cambió, después del refuerzo, a una respuesta TH1.
No se comprende cómo funcionan estos diferentes métodos, las formas de antígeno expresado y los diferentes perfiles de ayuda de las células T. Se pensaba que las cantidades relativamente grandes de ADN utilizadas en la inyección IM eran responsables de la inducción de respuestas TH1. Sin embargo, la evidencia no muestra diferencias relacionadas con la dosis en el tipo de TH. [41] El tipo de ayuda de células T generada está determinada por el estado diferenciado de las células presentadoras de antígenos . Las células dendríticas pueden diferenciarse para secretar IL-12 (que favorece el desarrollo de las células TH1) o IL-4 (que favorece las respuestas TH2). [44] El pDNA inyectado con aguja se endocitosa en la célula dendrítica, que luego se estimula para diferenciarse para la producción de citocina TH1 (IL-12), [45] mientras que la pistola genética bombardea el ADN directamente dentro de la célula, evitando así la estimulación de TH1.
La polarización en la ayuda de las células T es útil para influir en las respuestas alérgicas y las enfermedades autoinmunes . En las enfermedades autoinmunes, el objetivo es cambiar la respuesta TH1 autodestructiva (con su actividad de células T citotóxica asociada) a una respuesta TH2 no destructiva. Esto se ha aplicado con éxito en la preparación previa a la enfermedad para el tipo de respuesta deseado en modelos preclínicos [7] y tiene cierto éxito en cambiar la respuesta para una enfermedad establecida. [46]
Una de las ventajas de las vacunas de ADN es que pueden inducir linfocitos T citotóxicos (CTL) sin el riesgo inherente asociado a las vacunas vivas. Las respuestas de CTL pueden generarse contra epítopos de CTL inmunodominantes e inmunorecesivos, [47] así como contra epítopos de CTL subdominantes , [34] [ jerga ] de una manera que parece imitar la infección natural . Esto puede resultar una herramienta útil para evaluar los epítopos de CTL y su papel en la provisión de inmunidad.
Las células T citotóxicas reconocen pequeños péptidos (8-10 aminoácidos ) formando complejos con moléculas MHC de clase I. [48] Estos péptidos se derivan de proteínas citosólicas que se degradan y se entregan a la molécula naciente MHC de clase I dentro del retículo endoplásmico (RE). [48] Dirigirse los productos genéticos directamente al RE (mediante la adición de una secuencia señal de inserción del RE en el extremo N ) debería mejorar las respuestas de los CTL. Esto se demostró con éxito utilizando virus vaccinia recombinantes que expresan proteínas de la influenza , [48] pero el principio también debería ser aplicable a las vacunas de ADN. Se demostró que dirigirse a los antígenos para la degradación intracelular (y, por tanto, la entrada en la vía del MHC de clase I) mediante la adición de secuencias señal de ubiquitina , o la mutación de otras secuencias señal, es eficaz para aumentar las respuestas de los CTL. [28]
Las respuestas de CTL se pueden mejorar mediante la coinoculación con moléculas coestimuladoras como B7-1 o B7-2 para vacunas de ADN contra la nucleoproteína de la influenza, [47] [49] o GM-CSF para vacunas de ADN contra el modelo P de malaria murina. yoelii . [50] Se demostró que la coinoculación con plásmidos que codifican moléculas coestimuladoras IL-12 y TCA3 aumenta la actividad de los CTL contra los antígenos nucleoproteicos del VIH-1 y la influenza. [49] [51]
Las respuestas de anticuerpos provocadas por las vacunas de ADN están influenciadas por múltiples variables, incluido el tipo de antígeno; localización del antígeno (es decir, intracelular frente a secretada); número, frecuencia y dosis de inmunización; Sitio y método de administración del antígeno.
Las respuestas humorales después de una única inyección de ADN pueden ser mucho más duraderas que después de una única inyección de una proteína recombinante. Las respuestas de los anticuerpos contra la proteína de la envoltura del virus de la hepatitis B (VHB) (HBsAg) se han mantenido durante hasta 74 semanas sin refuerzo, mientras que el mantenimiento de por vida de la respuesta protectora a la hemaglutinina de la influenza se demostró en ratones después de la administración de una pistola genética. [52] Las células secretoras de anticuerpos (ASC) migran a la médula ósea y al bazo para la producción de anticuerpos a largo plazo y generalmente se localizan allí después de un año. [52]
Las comparaciones de las respuestas de anticuerpos generadas por infección natural (viral), inmunización con proteína recombinante e inmunización con pDNA se resumen en la Tabla 4. Las respuestas de anticuerpos generadas por ADN aumentan mucho más lentamente que cuando ocurre una infección natural o una inmunización con proteína recombinante. Es posible que se necesiten hasta 12 semanas para alcanzar los títulos máximos en ratones, aunque el refuerzo puede disminuir el intervalo. Esta respuesta probablemente se deba a los bajos niveles de antígeno expresados durante varias semanas, lo que respalda las fases primaria y secundaria de la respuesta de anticuerpos. [ se necesita aclaración ] Se inyectó una vacuna de ADN que expresa la proteína de la envoltura pequeña y media del VHB en adultos con hepatitis crónica. La vacuna dio lugar a la producción específica de células de interferón gamma. También se desarrollaron células T específicas para los antígenos de las proteínas de la envoltura media. La respuesta inmune de los pacientes no fue lo suficientemente sólida como para controlar la infección por VHB [53]
Además, los títulos de anticuerpos específicos generados por la vacunación con ADN son más bajos que los obtenidos después de la vacunación con una proteína recombinante. Sin embargo, los anticuerpos inducidos por la inmunización con ADN muestran una mayor afinidad por los epítopos nativos que los anticuerpos inducidos por proteínas recombinantes. En otras palabras, la inmunización con ADN induce una respuesta cualitativamente superior. Los anticuerpos se pueden inducir después de una vacunación con ADN, mientras que las vacunaciones con proteínas recombinantes generalmente requieren un refuerzo. La inmunización con ADN se puede utilizar para sesgar el perfil TH de la respuesta inmunitaria y, por tanto, el isotipo del anticuerpo, lo que no es posible ni con la infección natural ni con la inmunización con proteínas recombinantes. Las respuestas de anticuerpos generadas por el ADN son útiles como herramienta preparativa. Por ejemplo, se pueden generar anticuerpos policlonales y monoclonales para su uso como reactivos. [ cita necesaria ]
Cuando la captación de ADN y su posterior expresión se demostró por primera vez in vivo en células musculares , [54] se pensó que estas células eran únicas debido a su extensa red de túbulos T. Utilizando microscopía electrónica , se propuso que la captación de ADN se veía facilitada por las caveolas (o fosas no recubiertas de clatrina). [55] Sin embargo, investigaciones posteriores revelaron que otras células (como los queratinocitos , los fibroblastos y las células epiteliales de Langerhans ) también podrían internalizar el ADN. [46] [56] Se desconoce el mecanismo de absorción del ADN.
Predominan dos teorías: que la captación in vivo de ADN se produce de forma no específica, mediante un método similar a la fago , o la pinocitosis , [21] o a través de receptores específicos. [57] Estos podrían incluir un receptor de superficie de 30 kDa o receptores eliminadores de macrófagos . [ aclaración necesaria ] El receptor de superficie de 30 kDa se une específicamente a fragmentos de ADN de 4500 pb (que luego se internalizan) y se encuentra en las APC y las células T profesionales. Los receptores eliminadores de macrófagos se unen a una variedad de macromoléculas, incluidos los polirribonucleótidos y, por lo tanto, son candidatos para la captación de ADN. [57] [58] La captación de ADN mediada por receptores podría verse facilitada por la presencia de secuencias de poliguanilato . [ aclaración necesaria ] [ cita necesaria ] Los sistemas de administración de pistolas genéticas , los envases de liposomas catiónicos y otros métodos de administración evitan este método de entrada, pero comprenderlo puede ser útil para reducir costos (por ejemplo, al reducir el requisito de citofectinas), lo que podría ser importante en la cría de animales.
Los estudios con ratones quiméricos han demostrado que el antígeno es presentado por células derivadas de la médula ósea, que incluyen células dendríticas, macrófagos y células B especializadas llamadas células presentadoras de antígeno profesionales (APC). [49] [59] Después de la inoculación de la pistola genética en la piel, las células de Langerhans transfectadas migran al ganglio linfático de drenaje para presentar antígenos. [7] Después de las inyecciones IM e ID, las células dendríticas presentan antígeno en el ganglio linfático de drenaje [56] y se han encontrado macrófagos transfectados en la sangre periférica. [60]
Además de la transfección directa de células dendríticas o macrófagos, el cebado cruzado se produce después de las entregas de ADN IM, ID y pistola genética. El cebado cruzado ocurre cuando una célula derivada de la médula ósea presenta péptidos de proteínas sintetizadas en otra célula en el contexto del MHC clase 1. Esto puede preparar respuestas de células T citotóxicas y parece ser importante para una respuesta inmune primaria completa. [7] [61]
La entrega de ADN IM e ID inicia respuestas inmunes de manera diferente. En la piel, los queratinocitos, los fibroblastos y las células de Langerhans captan y expresan antígenos y son responsables de inducir una respuesta primaria de anticuerpos. Las células de Langerhans transfectadas migran fuera de la piel (en 12 horas) al ganglio linfático de drenaje, donde preparan las respuestas secundarias de las células B y T. En el músculo esquelético, las células del músculo estriado se transfectan con mayor frecuencia, pero parecen no tener importancia en la respuesta inmune. En cambio, el ADN inoculado IM "se lava" en el ganglio linfático de drenaje en cuestión de minutos, donde las células dendríticas distales se transfectan y luego inician una respuesta inmune. Los miocitos transfectados parecen actuar como un "depósito" de antígeno para el tráfico de APC profesionales. [21] [54] [61]
La vacunación con ADN genera una memoria inmunitaria eficaz mediante la visualización de complejos antígeno-anticuerpo en las células dendríticas foliculares (FDC), que son potentes estimuladores de las células B. Las células T pueden ser estimuladas por células dendríticas similares del centro germinal. Las FDC pueden generar una memoria inmune porque la producción de anticuerpos se "superpone" a la expresión a largo plazo del antígeno, lo que permite que las FDC formen inmunocomplejos antígeno-anticuerpo y los muestren. [7]
Tanto las células T auxiliares como las citotóxicas pueden controlar las infecciones virales mediante la secreción de interferones. Las células T citotóxicas suelen matar las células infectadas por virus. Sin embargo, también se pueden estimular para que secreten citocinas antivirales como IFN-γ y TNF-α , que no matan la célula, pero limitan la infección viral al regular negativamente la expresión de los componentes virales. [62] Las vacunas de ADN se pueden utilizar para frenar las infecciones virales mediante un control no destructivo mediado por IFN. Esto se demostró para la hepatitis B. [63] El IFN-γ es de importancia crítica para controlar las infecciones por malaria [64] y es una consideración para las vacunas de ADN contra la malaria.
Una vacuna eficaz debe inducir una respuesta inmunitaria adecuada para un patógeno determinado. Las vacunas de ADN pueden polarizar el soporte de las células T hacia perfiles TH1 o TH2 y generar CTL y/o anticuerpos cuando sea necesario. Esto se puede lograr mediante modificaciones en la forma del antígeno expresado (es decir, intracelular frente a secretado), el método y la vía de administración o la dosis. [41] [42] [65] [66] [67] También se puede lograr mediante la coadministración de ADN plasmídico que codifica moléculas reguladoras inmunitarias, es decir, citocinas, linfocinas o moléculas coestimuladoras. Estos " coadyuvantes genéticos " se pueden administrar como:
En general, la coadministración de agentes proinflamatorios (como diversas interleucinas , factor de necrosis tumoral y GM-CSF) más citocinas inductoras de TH2 aumentan las respuestas de anticuerpos, mientras que los agentes proinflamatorios y las citocinas inductoras de TH1 disminuyen las respuestas humorales y aumentan respuestas citotóxicas (más importantes en la protección viral). A veces se utilizan moléculas coestimuladoras como B7-1 , B7-2 y CD40L .
Este concepto se aplicó en la administración tópica de pDNA que codifica IL-10 . [33] El plásmido que codifica B7-1 (un ligando de las APC) mejoró con éxito la respuesta inmunitaria en modelos tumorales. La mezcla de plásmidos que codifican GM-CSF y la proteína circumsporozoito de P. yoelii (PyCSP) mejoró la protección contra la exposición posterior (mientras que PyCSP codificado por plásmido solo no lo hizo). Se propuso que el GM-CSF hacía que las células dendríticas presentaran antígenos de manera más eficiente y mejoraran la producción de IL-2 y la activación de las células TH, impulsando así una mayor respuesta inmune. [50] Esto se puede mejorar aún más cebando primero con una mezcla de pPyCSP y pGM-CSF, seguido de un refuerzo con un poxvirus recombinante que exprese PyCSP. [68] Sin embargo, la coinyección de plásmidos que codifican GM-CSF (o IFN-γ, o IL-2) y una proteína de fusión de la proteína de superficie del merozoito de P. chabaudi 1 (extremo C)-proteína de superficie del virus de la hepatitis B (PcMSP1 -HBs) abolió la protección contra la exposición, en comparación con la protección adquirida mediante la administración de pPcMSP1-HBs únicamente. [30]
Las ventajas de los adyuvantes genéticos son su bajo coste y su sencilla administración, así como la evitación de citocinas recombinantes inestables y de adyuvantes "convencionales" potencialmente tóxicos (como el alumbre , el fosfato cálcico , el monofosforil lípido A, la toxina del cólera , los liposomas catiónicos y recubiertos con manano). , QS21 , carboximetilcelulosa y ubenimix ). [7] [21] Sin embargo, no se ha establecido la toxicidad potencial de la expresión prolongada de citoquinas. En muchas especies animales de importancia comercial, los genes de citoquinas no han sido identificados ni aislados. Además, diversas citocinas codificadas por plásmidos modulan el sistema inmunológico de forma diferente según el tiempo de administración. Por ejemplo, algunos ADN de plásmidos de citoquinas se administran mejor después del ADNp de inmunógeno, porque la administración previa o conjunta puede disminuir las respuestas específicas y aumentar las respuestas no específicas. [69]
El propio ADN plasmídico parece tener un efecto adyuvante sobre el sistema inmunológico. [6] [7] El ADN derivado de bacterias puede desencadenar mecanismos de defensa inmune innatos, la activación de células dendríticas y la producción de citoquinas TH1. [45] [70] Esto se debe al reconocimiento de ciertas secuencias de dinucleótidos CpG que son inmunoestimulantes. [66] [71] Las secuencias estimuladoras de CpG (CpG-S) ocurren veinte veces más frecuentemente en el ADN derivado de bacterias que en los eucariotas. Esto se debe a que los eucariotas exhiben una "supresión de CpG", es decir, los pares de dinucleótidos CpG ocurren con mucha menos frecuencia de lo esperado. Además, las secuencias de CpG-S están hipometiladas. Esto ocurre con frecuencia en el ADN bacteriano, mientras que los motivos CpG que se encuentran en los eucariotas están metilados en el nucleótido de citosina. Por el contrario, las secuencias de nucleótidos que inhiben la activación de una respuesta inmune (denominada neutralización de CpG o CpG-N) están sobrerrepresentadas en los genomas eucariotas. [72] La secuencia inmunoestimuladora óptima es un dinucleótido CpG no metilado flanqueado por dos purinas 5' y dos pirimidinas 3' . [66] [70] Además, las regiones flanqueantes fuera de este hexámero inmunoestimulador deben ser ricas en guanina para garantizar la unión y la absorción en las células diana.
El sistema innato trabaja con el sistema inmunológico adaptativo para generar una respuesta contra la proteína codificada por el ADN. Las secuencias de CpG-S inducen la activación policlonal de las células B y la regulación positiva de la expresión y secreción de citocinas. [73] Los macrófagos estimulados secretan IL-12, IL-18 , TNF-α, IFN-α, IFN-β e IFN-γ, mientras que las células B estimuladas secretan IL-6 y algo de IL-12. [21] [73] [74]
La manipulación de las secuencias CpG-S y CpG-N en la columna vertebral del plásmido de las vacunas de ADN puede garantizar el éxito de la respuesta inmune al antígeno codificado e impulsar la respuesta inmune hacia un fenotipo TH1. Esto es útil si un patógeno requiere una respuesta TH para protección. Las secuencias de CpG-S también se han utilizado como adyuvantes externos para la vacunación con ADN y proteínas recombinantes con tasas de éxito variables. Otros organismos con motivos CpG hipometilados han demostrado la estimulación de la expansión policlonal de las células B. [75] El mecanismo detrás de esto puede ser más complicado que la simple metilación: no se ha encontrado que el ADN murino hipometilado genere una respuesta inmune.
La mayor parte de la evidencia sobre secuencias CpG inmunoestimulantes proviene de estudios murinos. La extrapolación de estos datos a otras especies requiere precaución: las especies individuales pueden requerir diferentes secuencias flanqueantes, ya que las especificidades de unión de los receptores carroñeros varían entre especies. Además, especies como los rumiantes pueden ser insensibles a las secuencias inmunoestimulantes debido a su gran carga gastrointestinal.
Las respuestas inmunitarias preparadas con ADN pueden potenciarse mediante la administración de proteínas recombinantes o poxvirus recombinantes. Las estrategias de "prime-boost" con proteína recombinante han aumentado con éxito tanto el título de anticuerpos neutralizantes como la avidez y persistencia de los anticuerpos para inmunógenos débiles, como la proteína de la envoltura del VIH-1. [7] [76] Se ha demostrado que los refuerzos de virus recombinantes son muy eficaces para potenciar las respuestas de CTL preparadas con ADN. La preparación con ADN centra la respuesta inmune en el inmunógeno requerido, mientras que la estimulación con el virus recombinante proporciona una mayor cantidad de antígeno expresado, lo que conduce a un gran aumento en las respuestas de CTL específicas.
En varios estudios, las estrategias de refuerzo han tenido éxito a la hora de inducir protección contra el desafío de la malaria. Los ratones preparados con ADN plasmídico que codifica la proteína de superficie del circumsporozoito de Plasmodium yoelii (PyCSP), luego reforzados con un virus vaccinia recombinante que expresa la misma proteína, tuvieron niveles significativamente más altos de anticuerpos, actividad de CTL e IFN-γ y, por lo tanto, niveles más altos de protección, que los ratones inmunizados. y reforzado con ADN plasmídico solo. [77] Esto se puede mejorar aún más cebando con una mezcla de plásmidos que codifican PyCSP y GM-CSF murino, antes de reforzar con virus vaccinia recombinante. [68] También se ha demostrado una estrategia eficaz de refuerzo-cebado para el modelo de malaria en simios P. knowlesi . [78] Los monos Rhesus fueron preparados con una vacuna de ADN multicomponente y de múltiples etapas que codifica dos antígenos de la etapa hepática: la proteína de superficie del circumsporozoito (PkCSP) y la proteína de superficie del esporozoito 2 (PkSSP2), y dos antígenos de la etapa sanguínea: la proteína de superficie del merozoito apical 1 ( PkAMA1) y proteína de superficie de merozoitos 1 (PkMSP1p42). Luego fueron reforzados con un virus de la viruela del canario recombinante que codifica los cuatro antígenos (ALVAC-4). Los monos inmunizados desarrollaron anticuerpos contra esporozoitos y eritrocitos infectados, y respuestas de células T secretoras de IFN-γ contra péptidos de PkCSP. Se logró una protección parcial contra la exposición a esporozoitos y la parasitemia media se redujo significativamente en comparación con los monos de control. Estos modelos, si bien no son ideales para la extrapolación a P. falciparum en humanos, serán importantes en los ensayos preclínicos.
La eficacia de la inmunización con ADN se puede mejorar estabilizando el ADN contra la degradación y aumentando la eficacia de la administración de ADN a las células presentadoras de antígenos . [7] Esto se ha demostrado recubriendo micropartículas catiónicas biodegradables (como la poli(lactida-co-glicolida) formulada con bromuro de cetiltrimetilamonio ) con ADN. Estas micropartículas recubiertas de ADN pueden ser tan eficaces para generar CTL como los virus recombinantes, especialmente cuando se mezclan con alumbre. Las partículas de 300 nm de diámetro parecen ser más eficaces para la captación por las células presentadoras de antígenos. [7]
Se han utilizado vectores recombinantes basados en alfavirus para mejorar la eficacia de la vacunación con ADN. [7] El gen que codifica el antígeno de interés se inserta en el replicón del alfavirus, reemplazando los genes estructurales pero dejando intactos los genes de replicasa no estructurales. Se han utilizado el virus Sindbis y el virus del bosque Semliki para construir replicones de alfavirus recombinantes . A diferencia de las vacunas de ADN convencionales, los vectores de alfavirus matan las células transfectadas y sólo se expresan de forma transitoria. Los genes de la alfavirus replicasa se expresan además del inserto de la vacuna. No está claro cómo los replicones de alfavirus generan una respuesta inmune, pero puede deberse a los altos niveles de proteína expresada por este vector, respuestas de citoquinas inducidas por replicones o apoptosis inducida por replicones que conduce a una mayor absorción de antígeno por parte de las células dendríticas.
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