En ingeniería genética , una pistola genética o sistema de suministro de partículas biolísticas es un dispositivo utilizado para suministrar ADN exógeno ( transgenes ), ARN o proteínas a las células. Al recubrir partículas de un metal pesado con un gen de interés y disparar estos microproyectiles a las células mediante fuerza mecánica, se puede introducir una integración de la información genética deseada en las células deseadas. La técnica involucrada en dicho suministro de ADN mediante microproyectiles a menudo se conoce como biolística , abreviatura de "balística biológica". [1] [2]
Este dispositivo es capaz de transformar casi cualquier tipo de célula y no se limita a la transformación del núcleo; también puede transformar orgánulos, incluidos plástidos y mitocondrias . [3]
La pistola genética era originalmente una pistola de aire comprimido Crosman modificada para disparar partículas densas de tungsteno . Fue inventada por John C Sanford , Ed Wolf y Nelson Allen en la Universidad de Cornell [4] [5] [6] junto con Ted Klein de DuPont entre 1983 y 1986. El objetivo original eran las cebollas (elegidas por el gran tamaño de sus células), y el dispositivo se utilizó para lanzar partículas recubiertas con un gen marcador que transmitiría una señal si se producía la inserción adecuada de la transcripción de ADN. [7] La transformación genética se demostró tras la expresión observada del gen marcador dentro de las células de cebolla.
Las primeras pistolas genéticas fabricadas a medida (fabricadas por Nelson Allen) utilizaban un cartucho de pistola de clavos de calibre 22 para impulsar un cilindro de polietileno (bala) a través de un cañón Douglas de calibre 22. Se colocaba una gota de polvo de tungsteno recubierto de material genético sobre la bala y se disparaba hacia una placa de Petri situada debajo. La bala se soldaba al disco que se encontraba debajo de la placa de Petri y el material genético se difundía en la muestra con un efecto de rosquilla que implicaba devastación en el medio de la muestra con un anillo de buena transformación alrededor de la periferia. La pistola estaba conectada a una bomba de vacío y se colocaba bajo vacío mientras disparaba. El diseño inicial se puso en producción limitada por un Rumsey-Loomis (un taller de maquinaria local que en ese entonces estaba en Mecklenburg Road en Ithaca, Nueva York, EE. UU.).
Biolistics, Inc. vendió a Dupont los derechos para fabricar y distribuir un dispositivo actualizado con mejoras que incluyen el uso de helio como propulsor no explosivo y un mecanismo de entrega por colisión de múltiples discos para minimizar el daño a los tejidos de la muestra. También se utilizan otros metales pesados como el oro y la plata para entregar material genético, siendo el oro el preferido debido a su menor citotoxicidad en comparación con los portadores de proyectiles de tungsteno. [8]
La transformación biolística implica la integración de un fragmento funcional de ADN, conocido como construcción de ADN, en las células diana. Una construcción genética es un casete de ADN que contiene todos los elementos reguladores necesarios para la expresión adecuada dentro del organismo diana. [9] [ página necesaria ] Si bien las construcciones genéticas pueden variar en su diseño dependiendo del resultado deseado del procedimiento de transformación, todas las construcciones contienen típicamente una combinación de una secuencia promotora , una secuencia terminadora , el gen de interés y un gen reportero .
Las pistolas genéticas se utilizan principalmente en células vegetales, pero también tienen un gran potencial de uso en seres humanos y otros animales.
El objetivo de una pistola genética suele ser un callo de células vegetales indiferenciadas o un grupo de embriones inmaduros que crecen en un medio de gel en una placa de Petri. Una vez que las partículas de oro recubiertas de ADN se han administrado a las células, el ADN se utiliza como plantilla para la transcripción (expresión transitoria) y, a veces, se integra en un cromosoma vegetal (transformación "estable").
Si el constructo de ADN administrado contiene un marcador seleccionable, entonces las células transformadas de manera estable pueden seleccionarse y cultivarse utilizando métodos de cultivo de tejidos. Por ejemplo, si el constructo de ADN administrado contiene un gen que confiere resistencia a un antibiótico o herbicida, entonces las células transformadas de manera estable pueden seleccionarse incluyendo ese antibiótico o herbicida en el medio de cultivo de tejidos.
Las células transformadas pueden ser tratadas con una serie de hormonas vegetales, como las auxinas y las giberelinas , y cada una de ellas puede dividirse y diferenciarse en células de tejido especializadas y organizadas de una planta entera. Esta capacidad de regeneración total se denomina totipotencia . La nueva planta que se originó a partir de una célula transformada con éxito puede tener nuevos rasgos que son hereditarios. El uso de la pistola genética puede contrastarse con el uso de Agrobacterium tumefaciens y su plásmido Ti para insertar ADN en células vegetales. Consulte la transformación para conocer los diferentes métodos de transformación en diferentes especies.
También se han utilizado pistolas genéticas para administrar vacunas de ADN .
La administración de plásmidos a neuronas de rata mediante el uso de una pistola de genes, específicamente neuronas DRG, también se utiliza como precursor farmacológico en el estudio de los efectos de enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer .
La pistola de genes se ha convertido en una herramienta habitual para etiquetar subconjuntos de células en tejidos cultivados. Además de poder transfectar células con plásmidos de ADN que codifican proteínas fluorescentes, la pistola de genes se puede adaptar para administrar una amplia variedad de colorantes vitales a las células. [16]
El bombardeo con armas genéticas también se ha utilizado para transformar Caenorhabditis elegans , como alternativa a la microinyección . [17]
La biolística ha demostrado ser un método versátil de modificación genética y generalmente se prefiere para diseñar cultivos resistentes a la transformación, como los cereales . Cabe destacar que el maíz Bt es un producto de la biolística. [9] [ página necesaria ] La transformación de plástidos también ha tenido un gran éxito con el bombardeo de partículas en comparación con otras técnicas actuales, como la transformación mediada por Agrobacterium , que tienen dificultades para dirigir el vector y expresarse de manera estable en el cloroplasto. [9] [ página necesaria ] [18] Además, no hay informes de un cloroplasto que silencie un transgén insertado con una pistola genética. [19] Además, con solo un disparo de una pistola genética, un técnico experto puede generar dos organismos transformados en ciertas especies. [18] Esta tecnología incluso ha permitido la modificación de tejidos específicos in situ , aunque es probable que esto dañe un gran número de células y transforme solo algunas , en lugar de todas, las células del tejido. [20]
La biolística introduce ADN de forma aleatoria en las células diana. De este modo, el ADN puede transformarse en cualquier genoma presente en la célula, ya sea nuclear, mitocondrial, plasmídico o cualquier otro, en cualquier combinación, aunque un diseño adecuado del constructo puede mitigar este problema. La administración e integración de múltiples plantillas del constructo de ADN es una posibilidad clara, lo que da como resultado niveles de expresión y números de copias del gen insertado potencialmente variables. [9] [ página necesaria ] Esto se debe a la capacidad de los constructos de dar y recibir material genético de otros constructos, lo que hace que algunos no lleven ningún transgén y otros lleven múltiples copias; el número de copias insertadas depende tanto de cuántas copias del transgén tenga un constructo insertado como de cuántas se hayan insertado. [9] [ página necesaria ] Además, debido a que las construcciones eucariotas dependen de la recombinación ilegítima —un proceso por el cual el transgén se integra en el genoma sin secuencias genéticas similares— y no de la recombinación homóloga , no se pueden dirigir a ubicaciones específicas dentro del genoma, [9] [ página necesaria ] a menos que el transgén se administre conjuntamente con reactivos de edición del genoma .