Una transcriptasa inversa ( RT ) es una enzima utilizada para generar ADN complementario (ADNc) a partir de una plantilla de ARN , un proceso denominado transcripción inversa . Las transcriptasas inversas son utilizadas por virus como el VIH y la hepatitis B para replicar sus genomas, por elementos genéticos móviles retrotransposones para proliferar dentro del genoma del huésped y por células eucariotas para extender los telómeros en los extremos de sus cromosomas lineales . Contrariamente a una creencia generalizada, el proceso no viola los flujos de información genética descritos por el dogma central clásico , ya que las transferencias de información del ARN al ADN se consideran explícitamente posibles. [2] [3] [4]
La RT retroviral tiene tres actividades bioquímicas secuenciales: actividad de ADN polimerasa dependiente de ARN , ribonucleasa H (RNasa H) y actividad de ADN polimerasa dependiente de ADN. En conjunto, estas actividades permiten que la enzima convierta el ARN monocatenario en ADNc bicatenario. En los retrovirus y retrotransposones, este ADNc puede luego integrarse en el genoma del huésped, a partir del cual se pueden realizar nuevas copias de ARN mediante la transcripción de la célula huésped . La misma secuencia de reacciones se usa ampliamente en el laboratorio para convertir ARN en ADN para su uso en clonación molecular , secuenciación de ARN , reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o análisis del genoma .
Las transcriptasas inversas fueron descubiertas por Howard Temin en la Universidad de Wisconsin-Madison en los viriones del sarcoma de Rous [5] y David Baltimore las aisló de forma independiente en 1970 en el MIT a partir de dos virus tumorales de ARN: el virus de la leucemia murina y nuevamente el virus del sarcoma de Rous . [6] Por sus logros, compartieron el Premio Nobel de Fisiología o Medicina de 1975 (con Renato Dulbecco ).
Las transcriptasas inversas bien estudiadas incluyen:
Las enzimas están codificadas y utilizadas por virus que utilizan la transcripción inversa como paso en el proceso de replicación. Los virus de ARN con transcripción inversa , como los retrovirus , utilizan la enzima para transcribir inversamente sus genomas de ARN en ADN, que luego se integra en el genoma del huésped y se replica junto con él. Los virus de ADN con transcripción inversa , como los hepadnavirus , pueden permitir que el ARN sirva como plantilla para ensamblar y formar cadenas de ADN. El VIH infecta a los humanos con el uso de esta enzima. Sin la transcriptasa inversa, el genoma viral no podría incorporarse a la célula huésped, lo que provocaría una falla en la replicación. [ cita necesaria ]
La transcriptasa inversa crea ADN bicatenario a partir de una plantilla de ARN.
En especies de virus con transcriptasa inversa que carecen de actividad ADN polimerasa dependiente de ADN, la creación de ADN bicatenario posiblemente puede realizarse mediante la ADN polimerasa codificada por el huésped δ , confundiendo el ADN-ARN viral con un cebador y sintetizando un ADN bicatenario mediante un Mecanismo similar al de la eliminación del cebador , donde el ADN recién sintetizado desplaza la plantilla de ARN original. [ cita necesaria ]
El proceso de transcripción inversa, también llamado retrotranscripción o retrotras, es extremadamente propenso a errores y es durante este paso cuando pueden ocurrir mutaciones. Estas mutaciones pueden causar resistencia a los medicamentos .
Los retrovirus , también conocidos como virus ssRNA-RT de clase VI , son virus de transcripción inversa de ARN con un intermediario de ADN. Sus genomas constan de dos moléculas de ARN monocatenario de sentido positivo con una tapa en 5' y una cola poliadenilada en 3' . Ejemplos de retrovirus incluyen el virus de la inmunodeficiencia humana ( VIH ) y el virus linfotrópico T humano ( HTLV ). La creación de ADN bicatenario ocurre en el citosol [10] mediante una serie de estos pasos:
La creación de ADN de doble hebra también implica la transferencia de hebras , en la que hay una translocación del producto corto de ADN desde la síntesis inicial de ADN dependiente de ARN a regiones plantilla aceptoras en el otro extremo del genoma, que luego son alcanzadas y procesadas por la transcriptasa inversa. por su actividad de ADN dependiente del ADN. [11]
El ARN retroviral está dispuesto en el extremo 5' al extremo 3'. El sitio donde el cebador se hibrida con el ARN viral se llama sitio de unión del cebador (PBS). El extremo 5' del ARN del sitio PBS se llama U5, y el extremo 3' del ARN del PBS se llama líder. El cebador de ARNt se desenrolla entre 14 y 22 nucleótidos y forma un dúplex de pares de bases con el ARN viral en PBS. El hecho de que el PBS esté ubicado cerca del extremo 5' del ARN viral es inusual porque la transcriptasa inversa sintetiza el ADN desde el extremo 3' del cebador en la dirección 5' a 3' (con respecto a la cadena de ADN recién sintetizada). Por lo tanto, el cebador y la transcriptasa inversa deben reubicarse en el extremo 3' del ARN viral. Para lograr esta reposición, se necesitan múltiples pasos y varias enzimas, incluida la ADN polimerasa , la ribonucleasa H (RNasa H) y el desenrollado de polinucleótidos. [12] [13]
La transcriptasa inversa del VIH también tiene actividad ribonucleasa que degrada el ARN viral durante la síntesis de ADNc, así como actividad ADN polimerasa dependiente de ADN que copia la cadena de ADNc sentido en un ADN antisentido para formar un intermediario de ADN viral bicatenario (ADNv). . [14] Los elementos estructurales del ARN viral del VIH regulan la progresión de la transcripción inversa. [15]
Los tramos autorreplicantes de genomas eucariotas conocidos como retrotransposones utilizan la transcriptasa inversa para moverse de una posición en el genoma a otra a través de un intermediario de ARN. Se encuentran abundantemente en los genomas de plantas y animales. La telomerasa es otra transcriptasa inversa que se encuentra en muchos eucariotas, incluidos los humanos, y que porta su propio molde de ARN ; este ARN se utiliza como plantilla para la replicación del ADN . [dieciséis]
Los informes iniciales sobre la transcriptasa inversa en procariotas se remontan a 1971 en Francia ( Beljanski et al., 1971a, 1972) y unos años más tarde en la URSS (Romashchenko 1977 [17] ). Desde entonces, se han descrito ampliamente como parte de retrones bacterianos , secuencias distintas que codifican la transcriptasa inversa y se utilizan en la síntesis de ADNms . Para iniciar la síntesis de ADN, se necesita un cebador. En las bacterias, el cebador se sintetiza durante la replicación. [18]
Valerian Dolja, del estado de Oregón, sostiene que los virus, debido a su diversidad, han desempeñado un papel evolutivo en el desarrollo de la vida celular, siendo la transcriptasa inversa un papel central. [19]
La transcriptasa inversa emplea una estructura de "mano derecha" similar a la que se encuentra en otras polimerasas de ácidos nucleicos virales . [20] [21] Además de la función de transcripción, las transcriptasas inversas retrovirales tienen un dominio que pertenece a la familia RNasa H , que es vital para su replicación. Al degradar el molde de ARN, se permite sintetizar la otra hebra de ADN. [22] Algunos fragmentos de la digestión también sirven como cebador para la ADN polimerasa (ya sea la misma enzima o una proteína huésped), responsable de producir la otra cadena (más). [20]
Existen tres sistemas de replicación diferentes durante el ciclo de vida de un retrovirus. El primer proceso es la síntesis de transcriptasa inversa de ADN viral a partir de ARN viral, que luego forma hebras de ADN complementarias recién creadas. El segundo proceso de replicación ocurre cuando la ADN polimerasa de la célula huésped replica el ADN viral integrado. Por último, la ARN polimerasa II transcribe el ADN proviral en ARN, que se empaquetará en viriones. La mutación puede ocurrir durante uno o todos estos pasos de replicación. [23]
La transcriptasa inversa tiene una alta tasa de error al transcribir ARN en ADN ya que, a diferencia de la mayoría de las otras ADN polimerasas , no tiene capacidad de corrección . Esta alta tasa de error permite que las mutaciones se acumulen a un ritmo acelerado en relación con las formas de replicación revisadas. Según sus manuales, las transcriptasas inversas disponibles comercialmente producidas por Promega tienen tasas de error en el rango de 1 en 17.000 bases para AMV y 1 en 30.000 bases para M-MLV. [24]
Además de crear polimorfismos de un solo nucleótido , también se ha demostrado que las transcriptasas inversas están involucradas en procesos como las fusiones de transcripciones, la mezcla de exones y la creación de transcripciones antisentido artificiales . [25] [26] Se ha especulado que esta actividad de cambio de plantilla de la transcriptasa inversa, que puede demostrarse completamente in vivo , puede haber sido una de las causas para encontrar varios miles de transcripciones sin anotar en los genomas de organismos modelo. [27]
En cada partícula de retrovirus se empaquetan dos genomas de ARN , pero, después de una infección, cada virus genera solo un provirus . [28] Después de la infección, la transcripción inversa va acompañada de un cambio de plantilla entre las dos copias del genoma (recombinación de elección de copia). [28] Hay dos modelos que sugieren por qué la ARN transcriptasa cambia de plantilla. El primero, el modelo de elección de copia forzada, propone que la transcriptasa inversa cambia la plantilla de ARN cuando encuentra una mella, lo que implica que la recombinación es obligatoria para mantener la integridad del genoma del virus. El segundo, el modelo de elección dinámica, sugiere que la transcriptasa inversa cambia las plantillas cuando la función de la ARNasa y la función de la polimerasa no están sincronizadas en cuanto a velocidad, lo que implica que la recombinación se produce al azar y no es en respuesta al daño genómico. Un estudio de Rawson et al. apoyó ambos modelos de recombinación. [28] En cada ciclo de replicación se producen de 5 a 14 eventos de recombinación por genoma. [29] El cambio de plantilla (recombinación) parece ser necesario para mantener la integridad del genoma y como mecanismo de reparación para recuperar genomas dañados. [30] [28]
Como el VIH utiliza la transcriptasa inversa para copiar su material genético y generar nuevos virus (parte de un círculo de proliferación de retrovirus), se han diseñado medicamentos específicos para interrumpir el proceso y así suprimir su crecimiento. En conjunto, estos medicamentos se conocen como inhibidores de la transcriptasa inversa e incluyen los análogos de nucleósidos y nucleótidos zidovudina (nombre comercial Retrovir), lamivudina (Epivir) y tenofovir (Viread), así como inhibidores no nucleósidos, como nevirapina (Viramune). [ cita necesaria ]
La transcriptasa inversa se usa comúnmente en la investigación para aplicar la técnica de reacción en cadena de la polimerasa al ARN en una técnica llamada reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR). La técnica de PCR clásica sólo se puede aplicar a cadenas de ADN , pero, con la ayuda de la transcriptasa inversa, el ARN se puede transcribir en ADN, lo que hace posible el análisis por PCR de moléculas de ARN. La transcriptasa inversa también se utiliza para crear bibliotecas de ADNc a partir de ARNm . La disponibilidad comercial de la transcriptasa inversa mejoró enormemente el conocimiento en el área de la biología molecular, ya que, junto con otras enzimas , permitió a los científicos clonar, secuenciar y caracterizar el ARN.
