Enzima que sintetiza ARN a partir de una plantilla de ARN.
La ARN polimerasa dependiente de ARN ( RdRp ) o ARN replicasa es una enzima que cataliza la replicación de ARN a partir de una plantilla de ARN. Específicamente, cataliza la síntesis de la cadena de ARN complementaria a un molde de ARN determinado. Esto contrasta con las típicas ARN polimerasas dependientes de ADN , que todos los organismos utilizan para catalizar la transcripción de ARN a partir de una plantilla de ADN .
RdRp es una proteína esencial codificada en los genomas de la mayoría de los virus que contienen ARN que carecen de una etapa de ADN, [1] [2] incluido el SARS-CoV-2 . Algunos eucariotas también contienen RdRps, que participan en la interferencia del ARN y se diferencian estructuralmente de los RdRps virales.
Historia
Los RdRps virales se descubrieron a principios de la década de 1960 a partir de estudios sobre mengovirus y virus de la polio cuando se observó que estos virus no eran sensibles a la actinomicina D , un fármaco que inhibe la síntesis de ARN dirigida por el ADN celular. Esta falta de sensibilidad sugirió la acción de una enzima específica del virus que podría copiar el ARN de una plantilla de ARN. [3]
Distribución
Los RdRps están altamente conservados en los virus y están relacionados con la telomerasa , aunque la razón de esto era una pregunta en curso en 2009. [4] La similitud llevó a la especulación de que los RdRps virales son ancestrales de la telomerasa humana. [5]
El ejemplo más famoso de RdRp es el virus de la polio . El genoma viral está compuesto de ARN, que ingresa a la célula mediante endocitosis mediada por receptores . A partir de ahí, el ARN actúa como plantilla para la síntesis de ARN complementario. La cadena complementaria actúa como plantilla para la producción de nuevos genomas virales que se empaquetan y liberan de la célula listos para infectar más células huésped. La ventaja de este método de replicación es que ninguna etapa del ADN complica la replicación. La desventaja es que no se dispone de una copia de ADN de "respaldo". [6]
Muchos eucariotas tienen RdRps que intervienen en la interferencia del ARN : estos amplifican los microARN y los pequeños ARN temporales y producen ARN bicatenario utilizando pequeños ARN de interferencia como cebadores. [8] Estos RdRps se utilizan en los mecanismos de defensa y pueden ser apropiados por los virus de ARN. [9] Su historia evolutiva es anterior a la divergencia de los principales grupos eucariotas. [10]
Replicación
RdRp se diferencia de la ARN polimerasa dependiente de ADN en que cataliza la síntesis de hebras de ARN complementarias a una plantilla de ARN determinada. El proceso de replicación del ARN es un mecanismo de cuatro pasos:
Unión de nucleósido trifosfato (NTP): inicialmente, RdRp presenta un sitio activo vacante en el que se une un NTP, complementario al nucleótido correspondiente en la cadena plantilla. La unión NTP correcta hace que RdRp sufra un cambio conformacional. [11]
Cierre del sitio activo: el cambio conformacional, iniciado por la unión correcta de NTP, da como resultado la restricción del acceso al sitio activo y produce un estado catalíticamente competente. [11]
Formación de enlaces fosfodiéster : dos iones Mg 2+ están presentes en estado catalíticamente activo y se organizan alrededor de la cadena de ARN recién sintetizada de manera que el sustrato NTP sufre una transferencia de fosfatidilo y forma un enlace fosfodiéster con la nueva cadena. [12] Sin el uso de estos iones Mg 2+ , el sitio activo ya no es catalíticamente estable y el complejo RdRp cambia a una conformación abierta. [12]
Translocación: una vez que el sitio activo está abierto, la cadena plantilla de ARN se mueve una posición a través del complejo proteico RdRp y continúa el alargamiento de la cadena uniéndose a un nuevo NTP, a menos que la plantilla especifique lo contrario. [11]
La síntesis de ARN se puede realizar mediante un mecanismo independiente del cebador ( de novo ) o dependiente del cebador que utiliza un cebador ligado al genoma de una proteína viral (VPg). [13] La iniciación de novo consiste en la adición de un NTP al 3'-OH del primer NTP iniciador. [13] Durante la siguiente fase de elongación, esta reacción de transferencia de nucleotidilo se repite con NTP posteriores para generar el producto de ARN complementario. La terminación de la cadena de ARN naciente producida por RdRp no se conoce completamente; sin embargo, la terminación de RdRp es independiente de la secuencia. [14]
Un inconveniente importante de la replicación de la ARN polimerasa dependiente de ARN es la tasa de error de transcripción. [13] Los RdRps carecen de fidelidad del orden de 10 4 nucleótidos, lo que se cree que es un resultado directo de una revisión inadecuada. [13] Esta tasa de variación se ve favorecida en los genomas virales, ya que permite que el patógeno supere las defensas del huésped tratando de evitar la infección, lo que permite el crecimiento evolutivo. [15]
Estructura
RdRp viral/procariota, junto con muchos DdRp de una sola subunidad, emplean un pliegue cuya organización se ha relacionado con la forma de una mano derecha con tres subdominios denominados dedos, palma y pulgar. [16] Sólo el subdominio de la palma, compuesto por una lámina beta antiparalela de cuatro cadenas con dos hélices alfa , está bien conservado. En RdRp, el subdominio palm comprende tres motivos bien conservados (A, B y C). El motivo A (Dx(4,5)-D) y el motivo C (GDD) están yuxtapuestos espacialmente; los residuos de ácido aspártico de estos motivos están implicados en la unión de Mg 2+ y/o Mn 2+ . El residuo de asparagina del motivo B participa en la selección de ribonucleósidos trifosfato sobre dNTP y, por tanto, determina si se sintetiza ARN en lugar de ADN. [17] La organización del dominio [18] y la estructura 3D del centro catalítico de una amplia gama de RdRps, incluso aquellos con una baja homología de secuencia general, se conservan. El centro catalítico está formado por varios motivos que contienen residuos de aminoácidos conservados. [ cita necesaria ]
La interferencia del ARN eucariota requiere una RdRp celular (c RdRp). A diferencia de las polimerasas "manuales", se parecen a las DdRP de múltiples subunidades simplificadas, específicamente en las subunidades catalíticas β/β', en el sentido de que utilizan dos conjuntos de barriles β de doble psi en el sitio activo. QDE1 ( Q9Y7G6 ) en Neurospora crassa , que tiene ambos barriles en la misma cadena, [19] es un ejemplo de dicha enzima ac RdRp. [20] Los homólogos de bacteriófagos de c RdRp, incluido el DdRp yonO de cadena sencilla similar ( O31945 ), parecen estar más cerca de c RdRps que los DdRP. [8] [21]
Virus
Cuatro superfamilias de virus cubren todos los virus que contienen ARN sin etapa de ADN:
Virus que contienen ARN de cadena positiva o ARN de doble cadena, excepto retrovirus y Birnaviridae
Todos los virus eucariotas de ARN de cadena positiva sin etapa de ADN, como Coronaviridae
Todos los bacteriófagos que contienen ARN ; Las dos familias de bacteriófagos que contienen ARN son Fiersviridae (fagos de ARNss positivos) y Cystoviridae (fagos de ARNds).
Los flavivirus producen una poliproteína del genoma de ssRNA. La poliproteína se escinde en varios productos, uno de los cuales es NS5, un RdRp. Posee regiones cortas y motivos homólogos a otros RdRps. [22]
La ARN replicasa que se encuentra en los virus ssRNA de cadena positiva está relacionada entre sí, formando tres grandes superfamilias. [23] La ARN replicasa birnaviral es única porque carece del motivo C (GDD) en la palma. [24] El mononegaviral RdRp (PDB 5A22) se ha clasificado automáticamente como similar a (+)-ssRNA RdRps, específicamente uno de Pestivirus y otro de Leviviridae . [25] El monómero Bunyaviral RdRp (PDB 5AMQ) se parece al complejo heterotrimérico del ortomixoviral (Influenza; PDB 4WSB) RdRp. [26]
Dado que es una proteína universal para los virus que contienen ARN, RdRp es un marcador útil para comprender su evolución. [27] [28]
Recombinación
Al replicar su genoma (+)ssRNA , el poliovirus RdRp es capaz de realizar recombinación . La recombinación parece ocurrir mediante un mecanismo de elección de copia en el que RdRp cambia las plantillas de ARNss (+) durante la síntesis de la cadena negativa. [29] La frecuencia de recombinación está determinada en parte por la fidelidad de la replicación de RdRp. [30] Las variantes de RdRp con alta fidelidad de replicación muestran una recombinación reducida, y las RdRp de baja fidelidad exhiben una mayor recombinación. [30] La recombinación mediante el cambio de cadena RdRp ocurre con frecuencia durante la replicación en los carmovirus y tombusvirus de plantas de ARNss (+) . [31]
Complementación intragénica
El virus Sendai (familia Paramyxoviridae ) tiene un genoma de ARN lineal, monocatenario, de sentido negativo y no segmentado. El RdRp viral consta de dos subunidades codificadas por el virus, una P más pequeña y una L más grande. Al probar diferentes mutantes de RdRp inactivos con defectos a lo largo de la subunidad L en combinaciones por pares, se observó la restauración de la síntesis de ARN viral en algunas combinaciones. [32] Esta interacción L-L positiva se conoce como complementación intragénica e indica que la proteína L es un oligómero en el complejo de ARN polimerasa viral. [ cita necesaria ]
Terapias con medicamentos
Los RdRps se pueden utilizar como objetivos farmacológicos para patógenos virales, ya que su función no es necesaria para la supervivencia de los eucariotas. Al inhibir la función RdRp, los nuevos ARN no se pueden replicar a partir de una cadena molde de ARN; sin embargo, la ARN polimerasa dependiente de ADN sigue siendo funcional.
El trifosfato GS-441524 es un sustrato para RdRp, pero no para polimerasas de mamíferos. Da como resultado la terminación prematura de la cadena y la inhibición de la replicación viral. El trifosfato GS-441524 es la forma biológicamente activa de remdesivir. Remdesivir se clasifica como un análogo de nucleótido que inhibe la función RdRp uniéndose covalentemente e interrumpiendo la terminación del ARN naciente mediante una terminación temprana o tardía o evitando un mayor alargamiento del polinucleótido de ARN. [34] [35] Esta terminación temprana conduce a un ARN no funcional que se degrada a través de procesos celulares normales.
interferencia de ARN
El uso de RdRp desempeña un papel importante en la interferencia del ARN en eucariotas, un proceso utilizado para silenciar la expresión génica mediante la unión de pequeños ARN de interferencia ( ARNip ) al ARNm, dejándolos inactivos. [36] La RdRp eucariota se vuelve activa en presencia de ARNbc y se distribuye menos ampliamente que otros componentes de ARNi, ya que se perdió en algunos animales, aunque todavía se encuentra en C. elegans , P. tetraurelia , [37] y plantas . [38] Esta presencia de ARNbc desencadena la activación de los procesos RdRp y ARNi al preparar el inicio de la transcripción del ARN mediante la introducción de ARNip. [37] En C. elegans , los ARNip se integran en el complejo silenciador inducido por ARN, RISC , que funciona junto con los ARNm destinados a la interferencia para reclutar más RdRps para sintetizar más ARNip secundarios y reprimir la expresión génica. [39]
^ Consulte el clan Pfam para conocer otras familias (+)ssRNA/dsRNA.
^ Una (-) polimerasa de ARNss.
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