Existen muchos métodos para investigar las interacciones proteína-proteína , que son los contactos físicos de alta especificidad que se establecen entre dos o más moléculas de proteína que involucran fuerzas electrostáticas y efectos hidrofóbicos . Cada uno de los enfoques tiene sus propias fortalezas y debilidades, especialmente con respecto a la sensibilidad y especificidad del método. [1] Una alta sensibilidad significa que muchas de las interacciones que ocurren son detectadas por el tamiz. Una alta especificidad indica que la mayoría de las interacciones detectadas por el tamiz están ocurriendo en la realidad.
La co-inmunoprecipitación se considera [ cita requerida ] como el ensayo de referencia para las interacciones proteína-proteína, especialmente cuando se realiza con proteínas endógenas (no sobreexpresadas y no marcadas ). La proteína de interés se aísla con un anticuerpo específico . Los socios de interacción que se adhieren a esta proteína se identifican posteriormente mediante transferencia Western . [2] Las interacciones detectadas por este enfoque se consideran reales. Sin embargo, este método solo puede verificar interacciones entre socios de interacción sospechosos. Por lo tanto, no es un enfoque de detección. Una nota de precaución también es que los experimentos de inmunoprecipitación revelan interacciones directas e indirectas. Por lo tanto, los resultados positivos pueden indicar que dos proteínas interactúan directamente o pueden interactuar a través de una o más moléculas puente. Esto podría incluir proteínas puente, ácidos nucleicos (ADN o ARN) u otras moléculas.
La complementación de fluorescencia bimolecular (BiFC) es una nueva técnica para observar las interacciones de las proteínas. En combinación con otras técnicas nuevas, este método se puede utilizar para analizar las interacciones proteína-proteína y sus moduladores, [3] DERB. [4]
La electroforesis de afinidad se utiliza para estimar constantes de unión , como por ejemplo en la electroforesis de afinidad de lectina o la caracterización de moléculas con características específicas como el contenido de glicanos o la unión de ligandos .
Los ensayos pull-down son una variación común de la inmunoprecipitación y la inmunoelectroforesis y se utilizan de manera idéntica, aunque este enfoque es más adecuado para una detección inicial de proteínas interactuantes.
La transferencia de etiquetas se puede utilizar para detectar o confirmar interacciones entre proteínas y puede proporcionar información sobre la interfaz en la que se produce la interacción. La transferencia de etiquetas también puede detectar interacciones débiles o transitorias que son difíciles de capturar utilizando otras estrategias de detección in vitro . En una reacción de transferencia de etiquetas, se etiqueta una proteína conocida con una etiqueta detectable. A continuación, la etiqueta se pasa a una proteína que interactúa, que luego puede identificarse por la presencia de la etiqueta.
La visualización de fagos se utiliza para la detección de alto rendimiento de interacciones de proteínas.
En 2005, investigadores del Instituto Max Planck introdujeron la reticulación in vivo de complejos proteicos utilizando análogos de aminoácidos fotorreactivos [5]. En este método, las células se cultivan con análogos de diazirina fotorreactivos de leucina y metionina , que se incorporan a las proteínas. Al exponerlas a la luz ultravioleta, las diazirinas se activan y se unen a las proteínas interactuantes que se encuentran a unos pocos angstroms del análogo de aminoácido fotorreactivo. [6]
El método de purificación por afinidad en tándem (TAP) permite una identificación de alto rendimiento de las interacciones de proteínas. A diferencia del enfoque de dos híbridos de levadura, la precisión del método se puede comparar con la de los experimentos a pequeña escala [7] y las interacciones se detectan dentro del entorno celular correcto, como por co-inmunoprecipitación . Sin embargo, el método de etiqueta TAP requiere dos pasos sucesivos de purificación de proteínas y, en consecuencia, no puede detectar fácilmente las interacciones transitorias proteína-proteína. Krogan et al. y Gavin et al. realizaron experimentos TAP recientes en todo el genoma que proporcionaron datos actualizados de interacción de proteínas para organismos de levadura. [8] [9]
La reticulación química se utiliza a menudo para "fijar" las interacciones de proteínas antes de intentar aislar o identificar las proteínas que interactúan. Los reticulantes habituales para esta aplicación incluyen el reticulante de éster NHS no escindible, suberato de bissulfosuccinimidilo (BS3); una versión escindible de BS3, ditiobis(sulfosuccinimidilo propionato) (DTSSP); y el reticulante de imidoéster dimetil ditiobispropionimidato (DTBP), que es popular para fijar interacciones en ensayos ChIP .
La reticulación química seguida de la espectrometría de masas MALDI de alta masa se puede utilizar para analizar las interacciones de proteínas intactas en el lugar antes de intentar aislar o identificar las proteínas que interactúan. Este método detecta interacciones entre proteínas no marcadas y está disponible en CovalX .
SPINE (experimento de interacción de estreptoproteínas) [10] utiliza una combinación de reticulación reversible con formaldehído y una incorporación de una etiqueta de afinidad para detectar socios de interacción in vivo .
La inmunoprecipitación cuantitativa combinada con knock-down (QUICK) se basa en la co-inmunoprecipitación, la espectrometría de masas cuantitativa ( SILAC ) y la interferencia de ARN (RNAi). Este método detecta interacciones entre proteínas endógenas no marcadas. [11] Por lo tanto, tiene el mismo alto nivel de confianza que la co-inmunoprecipitación. Sin embargo, este método también depende de la disponibilidad de anticuerpos adecuados.
El ensayo de ligadura de proximidad (PLA) in situ es un método inmunohistoquímico que utiliza las llamadas sondas PLA para la detección de proteínas, interacciones y modificaciones de proteínas. Cada sonda PLA viene con una cadena corta de ADN única unida a ella y se une a anticuerpos primarios específicos de la especie o consiste en anticuerpos primarios marcados directamente con ADN. [12] [13] Cuando las sondas PLA están muy próximas, las cadenas de ADN pueden interactuar mediante una adición posterior de otros dos oligonucleótidos de ADN formadores de círculos. Después de la unión de los dos oligonucleótidos añadidos mediante ligadura enzimática, se amplifican mediante amplificación de círculo rodante utilizando una polimerasa. Después de la reacción de amplificación, se ha producido una replicación de varios cientos de veces del círculo de ADN y las sondas de oligonucleótidos complementarias marcadas con fluoróforos o enzimas resaltan el producto. La alta concentración resultante de fluorescencia o señal cromogénica en cada producto de amplificación de una sola molécula es fácilmente visible como un punto brillante distintivo cuando se observa con un microscopio de fluorescencia o un microscopio de campo claro estándar.
La resonancia de plasmón superficial (SPR) es la técnica sin etiqueta más común para la medición de interacciones biomoleculares. [ cita requerida ] Los instrumentos SPR miden el cambio en el índice de refracción de la luz reflejada desde una superficie metálica (el "biosensor"). La unión de biomoléculas al otro lado de esta superficie conduce a un cambio en el índice de refracción que es proporcional a la masa agregada a la superficie del sensor. En una aplicación típica, un socio de unión (el "ligando", a menudo una proteína) se inmoviliza en el biosensor y una solución con socios de unión potenciales (el "analito") se canaliza sobre esta superficie. La acumulación de analito a lo largo del tiempo permite cuantificar las tasas de activación (kon), las tasas de desactivación (koff), las constantes de disociación (Kd) y, en algunas aplicaciones, las concentraciones activas del analito. [14] Varios proveedores diferentes ofrecen dispositivos basados en SPR. Los más conocidos son los instrumentos Biacore , que fueron los primeros disponibles comercialmente.
La interferometría de polarización dual (IPD) se puede utilizar para medir las interacciones entre proteínas. La IPD proporciona mediciones en tiempo real y de alta resolución del tamaño, la densidad y la masa molecular. Si bien no es necesario el marcado, una de las especies de proteína debe estar inmovilizada en la superficie de una guía de ondas. Además de la cinética y la afinidad, también se pueden cuantificar los cambios conformacionales durante la interacción.
La dispersión de luz estática (SLS) mide los cambios en la dispersión de Rayleigh de los complejos proteicos en solución y puede caracterizar interacciones tanto débiles como fuertes sin etiquetar o inmovilizar las proteínas u otras biomacromoléculas. La medición de dispersión de luz estática multiángulo con gradiente de composición (CG-MALS) mezcla una serie de alícuotas de diferentes concentraciones o composiciones, mide el efecto de los cambios en la dispersión de luz como resultado de la interacción y ajusta los cambios de dispersión de luz correlacionados con la concentración a una serie de modelos de asociación para encontrar el descriptor de mejor ajuste. Las interacciones débiles y no específicas se caracterizan típicamente a través del segundo coeficiente virial . Para la unión específica, este tipo de análisis puede determinar la estequiometría y las constantes de asociación de equilibrio de uno o más complejos asociados, [15] incluidos sistemas desafiantes como los que exhiben homo- y hetero-asociación simultánea, interacciones multivalentes y cooperatividad.
La dispersión de luz dinámica (DLS), también conocida como dispersión de luz cuasielástica (QELS), o espectroscopia de correlación de fotones, procesa las fluctuaciones dependientes del tiempo en la intensidad de la luz dispersada para producir el radio hidrodinámico de las partículas en solución. El radio hidrodinámico es el radio de una esfera sólida con el mismo coeficiente de difusión traslacional que el medido para la partícula de muestra. A medida que las proteínas se asocian, el radio hidrodinámico promedio de la solución aumenta. La aplicación del método de variación continua, también conocido como diagrama de Job , con el radio hidrodinámico de la solución como observable, permite la determinación in vitro de K d , la estequiometría compleja, el radio hidrodinámico complejo y el Δ H ° y el Δ S ° de las interacciones proteína-proteína. [16] Esta técnica no implica inmovilización o etiquetado. Se pueden caracterizar las interacciones transitorias y débiles. En relación con la dispersión de luz estática, que se basa en la intensidad absoluta de la luz dispersa, la DLS es insensible a la luz de fondo de las paredes de las estructuras que la contienen. Esta insensibilidad permite realizar mediciones DLS a partir de volúmenes de 1 μL en placas de 1536 pocillos y reduce los requisitos de muestra al rango de femtomoles. Esta técnica también es adecuada para la detección de componentes de tampón y/o inhibidores/efectores de moléculas pequeñas.
El análisis de dispersión inducida por flujo (FIDA) es una nueva tecnología basada en capilares y sin inmovilización que se utiliza para la caracterización y cuantificación de la interacción biomolecular y la concentración de proteínas en condiciones nativas. [17] La técnica se basa en medir el cambio en el tamaño aparente (radio hidrodinámico) de un ligando selectivo cuando interactúa con el analito de interés. Un ensayo FIDA funciona en soluciones complejas (por ejemplo, plasma [18] ) y proporciona información sobre la concentración de analito, las constantes de afinidad, el tamaño molecular y la cinética de unión. Un solo ensayo normalmente se completa en minutos y solo requiere un consumo de muestra de unos pocos μL. [17]
La polarización/anisotropía de la fluorescencia se puede utilizar para medir las interacciones proteína-proteína o proteína-ligando. Normalmente, se marca un compañero de unión con una sonda de fluorescencia (aunque a veces se puede utilizar la fluorescencia proteica intrínseca del triptófano) y la muestra se excita con luz polarizada. El aumento de la polarización de la fluorescencia tras la unión de la proteína marcada a su compañero de unión se puede utilizar para calcular la afinidad de unión.
Con la espectroscopia de correlación de fluorescencia , una proteína se marca con un tinte fluorescente y la otra se deja sin marcar. Luego, las dos proteínas se mezclan y los datos arrojan como resultado la fracción de la proteína marcada que no está unida y que está unida a la otra proteína, lo que le permite obtener una medida de K D y la afinidad de unión. También puede tomar medidas de la evolución temporal para caracterizar la cinética de unión. La FCS también le indica el tamaño de los complejos formados para que pueda medir la estequiometría de la unión. Un método más potente es la espectroscopia de correlación cruzada de fluorescencia (FCCS) que emplea técnicas de doble etiquetado y correlación cruzada, lo que da como resultado relaciones señal-ruido enormemente mejoradas en comparación con la FCS. Además, la excitación de dos y tres fotones prácticamente elimina los efectos de fotoblanqueo y proporciona un registro ultrarrápido de datos de FCCS o FCS.
La transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) es una técnica común para observar las interacciones de diferentes proteínas. [19] [20] [21] [22] Aplicada in vivo, la FRET se ha utilizado para detectar la ubicación e interacciones de genes y estructuras celulares, incluidas las integrinas y las proteínas de membrana. [23] La FRET se puede utilizar para obtener información sobre vías metabólicas o de señalización. [24] [25] [26]
La interferometría de biocapa (BLI) es una tecnología sin etiquetas para medir interacciones biomoleculares [27] [28] (proteína:proteína o proteína:molécula pequeña). Es una técnica analítica óptica que analiza el patrón de interferencia de la luz blanca reflejada desde dos superficies: una capa de proteína inmovilizada en la punta del biosensor y una capa de referencia interna. Cualquier cambio en el número de moléculas unidas a la punta del biosensor provoca un cambio en el patrón de interferencia que se puede medir en tiempo real, proporcionando información detallada sobre la cinética de asociación y disociación de las dos moléculas, así como la constante de afinidad para la interacción de la proteína (k a , k d y K d ). Debido a la configuración del sensor, la técnica es muy adecuada tanto para muestras purificadas como crudas, así como para experimentos de detección de alto rendimiento. El método de detección también se puede utilizar para determinar la concentración molar de analitos.
Determinación de la actividad proteica mediante mediciones de relajación multinuclear por RMN o espectroscopia RMN 2D-FT en soluciones, combinada con análisis de regresión no lineal de conjuntos de datos de relajación RMN o espectroscopia 2D-FT. Mientras que el concepto de actividad del agua es ampliamente conocido y utilizado en las biociencias aplicadas, su complemento (la actividad proteica que cuantifica las interacciones proteína-proteína) es mucho menos familiar para los biocientíficos, ya que es más difícil de determinar en soluciones diluidas de proteínas; la actividad proteica también es mucho más difícil de determinar para soluciones de proteínas concentradas cuando la agregación proteica, no meramente la asociación transitoria de proteínas, es a menudo el proceso dominante. [29]
La calorimetría de titulación isotérmica (CTI) se considera la técnica más cuantitativa disponible para medir las propiedades termodinámicas de las interacciones proteína-proteína y se está convirtiendo en una herramienta necesaria para los estudios estructurales de complejos proteína-proteína. Esta técnica se basa en la medición precisa de los cambios de calor que siguen a la interacción de las moléculas de proteína en solución, sin la necesidad de etiquetar o inmovilizar los socios de unión, ya que la absorción o producción de calor es una propiedad intrínseca de prácticamente todas las reacciones bioquímicas. La CTI proporciona información sobre la estequiometría, la entalpía, la entropía y la cinética de unión entre dos proteínas que interactúan. [30]
La termoforesis a microescala (MST) es un nuevo método que permite el análisis cuantitativo de interacciones moleculares en solución a escala de microlitros. La técnica se basa en la termoforesis de moléculas, que proporciona información sobre el tamaño de la molécula, la carga y la capa de hidratación. Dado que al menos uno de estos parámetros suele verse afectado al producirse la unión, el método se puede utilizar para el análisis de cada tipo de interacción o modificación biomolecular. El método funciona igualmente bien en tampones estándar y líquidos biológicos como sangre o lisado celular. Es un método de solución libre que no necesita inmovilizar los socios de unión. La MST proporciona información sobre la afinidad de unión, la estequiometría, la competencia y la entalpía de dos o más proteínas que interactúan. [31] [32]
El ensayo de unión de ligando basado en células rotatorias que utiliza radioactividad o fluorescencia es un método reciente que mide las interacciones moleculares en células vivas en tiempo real. Este método permite la caracterización del mecanismo de unión, así como K d , k on y k off . Este principio se está aplicando en varios estudios, principalmente con ligandos de proteínas y células de mamíferos vivos. [33] [34] [35] [36] Una tecnología alternativa para medir las interacciones de proteínas directamente en las células es la citometría de interacción en tiempo real (RT-IC). [37] En esta tecnología, las células vivas o fijadas se retienen físicamente en la superficie de chips biosensores utilizando trampas de polímero biocompatibles y permeables al flujo. [38] La unión y desunión de analitos marcados inyectados automáticamente se mide mediante detección de fluorescencia resuelta en el tiempo.
La reflectometría monocromática (SCORE) es una tecnología sin etiquetas que permite medir todo tipo de interacciones biomoleculares en tiempo real. De forma similar a la BLI, aprovecha los efectos de interferencia en capas delgadas. Sin embargo, no necesita una resolución espectral, sino que utiliza luz monocromática. De este modo, es posible analizar no solo una interacción única, sino matrices de alta densidad con hasta 10.000 interacciones por cm 2 . [39]
switchSENSE es una tecnología basada en nanopalancas de ADN sobre la superficie de un chip. Un colorante fluorescente , así como el ligando no marcado, se unen a esta nanopalanca. Tras la unión de un analito al ligando, las tasas cinéticas en tiempo real (k on , k off ) se pueden medir como cambios en la intensidad de la fluorescencia y se puede derivar la K d . Este método se puede utilizar para investigar las interacciones proteína-proteína, así como para investigar los moduladores de las interacciones proteína-proteína mediante la evaluación de la formación de complejos ternarios. Un ejemplo de dichos moduladores son los PROTAC , que se investigan por su potencial terapéutico en la terapia del cáncer. Otro ejemplo de dichas interacciones ternarias son los anticuerpos biespecíficos que se unen a sus dos antígenos distintos. [40] switchSENSE se puede utilizar además para detectar cambios conformacionales inducidos por la unión de ligandos a una proteína diana. [41]
Los métodos de cribado de dos híbridos de levadura y de dos híbridos de bacterias [42] investigan la interacción entre proteínas de fusión artificiales. No requieren el aislamiento de proteínas, sino que utilizan la transformación para expresar proteínas en bacterias o levaduras . Las células están diseñadas de manera que una interacción active la transcripción de un gen o una enzima reportera . [43]
La mayoría de los métodos de PPI requieren algún análisis computacional de datos. Los métodos de esta sección son principalmente computacionales, aunque normalmente requieren datos generados mediante experimentos de laboratorio.
Acoplamiento proteína-proteína : la predicción de interacciones proteína-proteína basada únicamente en las estructuras proteicas tridimensionales a partir de la difracción de rayos X de los cristales proteicos podría no ser satisfactoria. [44] [45]
El análisis de redes incluye el análisis de redes de interacción utilizando métodos de teoría de grafos o métodos estadísticos. El objetivo de estos estudios es comprender la naturaleza de las interacciones en el contexto de una célula o vía , no solo las interacciones individuales. [46]