Tipo de microscopio con electrones como fuente de iluminación.
Un microscopio electrónico de transmisión de 2002.Una imagen de una hormiga en un microscopio electrónico de barrido.
Un microscopio electrónico es un microscopio que utiliza un haz de electrones como fuente de iluminación. Utilizan óptica electrónica análoga a las lentes de vidrio de un microscopio óptico de luz para controlar el haz de electrones, por ejemplo enfocándolos para producir imágenes ampliadas o patrones de difracción de electrones . Como la longitud de onda de un electrón puede ser hasta 100.000 veces más pequeña que la de la luz visible, los microscopios electrónicos tienen una resolución mucho mayor , de aproximadamente 0,1 nm, en comparación con los aproximadamente 200 nm de los microscopios ópticos . [1] Microscopio electrónico puede referirse a:
Se pueden encontrar detalles adicionales en los enlaces anteriores. Este artículo contiene información general principalmente sobre microscopios electrónicos de transmisión.
Historia
Reproducción de uno de los primeros microscopios electrónicos construido por Ernst Ruska en la década de 1930.
Muchos avances sentaron las bases de la óptica electrónica utilizada en los microscopios. [2] Un paso significativo fue el trabajo de Hertz en 1883 [3], quien fabricó un tubo de rayos catódicos con deflexión electrostática y magnética, demostrando la manipulación de la dirección de un haz de electrones. Otros fueron el enfoque de los electrones mediante un campo magnético axial por Emil Wiechert en 1899, [4] los cátodos mejorados recubiertos de óxido que producían más electrones por Arthur Wehnelt en 1905 [5] y el desarrollo de la lente electromagnética en 1926 por Hans Busch . [6] Según Dennis Gabor , el físico Leó Szilárd intentó en 1928 convencerlo de que construyera un microscopio electrónico, para el cual Szilárd había presentado una patente. [7]
Hasta el día de hoy la cuestión de quién inventó el microscopio electrónico de transmisión sigue siendo controvertida. [8] [9] [10] [11] En 1928, en la Technische Hochschule de Charlottenburg (ahora Technische Universität Berlin ), Adolf Matthias (Profesor de Tecnología de Alto Voltaje e Instalaciones Eléctricas) nombró a Max Knoll para dirigir un equipo de investigadores para avanzar en la investigación sobre haces de electrones y osciloscopios de rayos catódicos. El equipo estaba formado por varios estudiantes de doctorado, entre ellos Ernst Ruska . En 1931, Max Knoll y Ernst Ruska [12] [13] generaron con éxito imágenes ampliadas de rejillas de malla colocadas sobre la apertura de un ánodo. El dispositivo, cuya réplica se muestra en la figura, utilizó dos lentes magnéticas para lograr mayores aumentos, el primer microscopio electrónico. (Max Knoll murió en 1969, por lo que no recibió parte del Premio Nobel de 1986 por la invención de los microscopios electrónicos).
Aparentemente, independiente de este esfuerzo fue el trabajo de Reinhold Rüdenberg en Siemens-Schuckert . Según la ley de patentes (patente estadounidense nº 2058914 [14] y 2070318, [15] ambas presentadas en 1932), es el inventor del microscopio electrónico, pero no está claro cuándo tenía un instrumento de trabajo. Afirmó en un artículo muy breve de 1932 [16] que Siemens había estado trabajando en esto durante algunos años antes de que se presentaran las patentes en 1932, alegando que su esfuerzo era paralelo al desarrollo universitario. Murió en 1961, por lo que, al igual que Max Knoll, no pudo optar a una parte del Premio Nobel de 1986. [17]
Al año siguiente, 1933, Ruska y Knoll construyeron el primer microscopio electrónico que superó la resolución de un microscopio óptico (luz). [18] Cuatro años más tarde, en 1937, Siemens financió el trabajo de Ernst Ruska y Bodo von Borries , y empleó a Helmut Ruska , hermano de Ernst, para desarrollar aplicaciones para el microscopio, especialmente con muestras biológicas. [18] [19] También en 1937, Manfred von Ardenne fue pionero en el microscopio electrónico de barrido . [20] Siemens produjo el primer microscopio electrónico comercial en 1938. [21] Los primeros microscopios electrónicos norteamericanos fueron construidos en la década de 1930, en la Universidad Estatal de Washington por Anderson y Fitzsimmons [22] y en la Universidad de Toronto por Eli Franklin Burton. y los estudiantes Cecil Hall, James Hillier y Albert Prebus. Siemens produjo un microscopio electrónico de transmisión (TEM) en 1939. [23] Aunque los microscopios electrónicos de transmisión actuales son capaces de aumentar dos millones de veces, como instrumentos científicos siguen siendo similares pero con una óptica mejorada.
En la década de 1940 se desarrollaron microscopios electrónicos de alta resolución, que permitieron una mayor ampliación y resolución. [24] En 1965, Albert Crewe de la Universidad de Chicago introdujo el microscopio electrónico de transmisión de barrido utilizando una fuente de emisión de campo , [25] permitiendo microscopios de barrido de alta resolución. [26] A principios de la década de 1980, las mejoras en la estabilidad mecánica, así como el uso de voltajes de aceleración más altos, permitieron obtener imágenes de materiales a escala atómica. [27] [28] En la década de 1980, el cañón de emisión de campo se volvió común en los microscopios electrónicos, mejorando la calidad de la imagen debido a la coherencia adicional y las menores aberraciones cromáticas. La década de 2000 estuvo marcada por avances en la microscopía electrónica con corrección de aberraciones, lo que permitió mejoras significativas en la resolución y claridad de las imágenes. [29] [30]
Tipos
Principio de funcionamiento de un microscopio electrónico de transmisión.
Microscopio electrónico de transmisión (TEM)
La forma original del microscopio electrónico, el microscopio electrónico de transmisión (TEM), utiliza un haz de electrones de alto voltaje para iluminar la muestra y crear una imagen. Un haz de electrones se produce mediante un cañón de electrones ; los electrones suelen tener energías en el rango de 20 a 400 keV, se enfocan mediante lentes electromagnéticas y se transmiten a través de la muestra. Cuando emerge de la muestra, el haz de electrones transporta información sobre la estructura de la muestra que se magnifica con las lentes del microscopio. La variación espacial de esta información (la "imagen") se puede ver proyectando la imagen electrónica ampliada en un detector . Por ejemplo, la imagen puede ser vista directamente por un operador usando una pantalla de visualización fluorescente recubierta con un material de fósforo o centelleo tal como sulfuro de zinc . También se puede acoplar un fósforo de alta resolución mediante un sistema óptico de lente o una guía de luz de fibra óptica al sensor de una cámara digital . Los detectores de electrones directos no tienen centelleador y están expuestos directamente al haz de electrones, lo que soluciona algunas de las limitaciones de las cámaras acopladas a centelleador. [31]
La resolución de los TEM está limitada principalmente por la aberración esférica , pero una nueva generación de correctores de hardware puede reducir la aberración esférica para aumentar la resolución en microscopía electrónica de transmisión de alta resolución (HRTEM) por debajo de 0,5 angstrom (50 picómetros ), [32] permitiendo aumentos. más de 50 millones de veces. [33] La capacidad de HRTEM para determinar las posiciones de los átomos dentro de los materiales es útil para la investigación y el desarrollo de nanotecnologías. [34]
Microscopio electrónico de transmisión de barrido (STEM)
El STEM traza una sonda incidente enfocada a través de una muestra. Por tanto, la alta resolución del TEM es posible en STEM. La acción de enfoque (y las aberraciones) ocurren antes de que los electrones golpeen la muestra en el STEM, pero después en el TEM. El uso de STEM de rasterización de haz tipo SEM simplifica la obtención de imágenes anulares de campo oscuro y otras técnicas analíticas, pero también significa que los datos de la imagen se adquieren en serie en lugar de en paralelo. [35]
Microscopio electrónico de barrido (SEM)
Principio de funcionamiento de un microscopio electrónico de barrido.Imagen de Bacillus subtilis tomada con un microscopio electrónico de los años 60
El SEM produce imágenes sondeando la muestra con un haz de electrones enfocado que se escanea a través de la muestra ( escaneo de trama ). Cuando el haz de electrones interactúa con la muestra, pierde energía mediante diversos mecanismos. Estas interacciones conducen, entre otros eventos, a la emisión de electrones secundarios de baja energía y electrones retrodispersados de alta energía, emisión de luz ( catodoluminiscencia ) o emisión de rayos X , todas las cuales proporcionan señales que transportan información sobre las propiedades de la superficie de la muestra, como como su topografía y composición. La imagen mostrada por SEM representa la intensidad variable de cualquiera de estas señales en la imagen en una posición correspondiente a la posición del haz en la muestra cuando se generó la señal. [36]
Los SEM se diferencian de los TEM en que utilizan electrones con energía mucho menor, generalmente por debajo de 20 keV, [37] mientras que los TEM generalmente utilizan electrones con energías en el rango de 80-300 keV. [38] Por lo tanto, las fuentes de electrones y la óptica de los dos microscopios tienen diseños diferentes y normalmente son instrumentos separados. [39]
Modos de funcionamiento principales
Imágenes de contraste de difracción
Imágenes de contraste de fase
Imágenes de alta resolución
Análisis químico
difracción de electrones
Los microscopios electrónicos de transmisión se pueden utilizar en modo de difracción de electrones , donde se produce un mapa de los ángulos de los electrones que salen de la muestra. Las ventajas de la difracción de electrones sobre la cristalografía de rayos X residen principalmente en el tamaño de los cristales. En cristalografía de rayos X, los cristales son comúnmente visibles a simple vista y generalmente tienen cientos de micrómetros de longitud. En comparación, los cristales para la difracción de electrones deben tener menos de unos pocos cientos de nanómetros de espesor y no tener un límite inferior de tamaño. Además, la difracción de electrones se realiza en un TEM, que también se puede utilizar para obtener muchos otros tipos de información, en lugar de requerir un instrumento separado. [40] [38]
Preparación de muestras para TEM
Un insecto recubierto de oro para observar con un microscopio electrónico de barrido.
Los materiales que se van a observar en un microscopio electrónico de transmisión pueden requerir procesamiento para producir una muestra adecuada. La técnica requerida varía según la muestra y el análisis requerido:
Criofijación : congelar una muestra para que el agua forme hielo vítreo (no cristalino) . Esto preserva el espécimen en una instantánea de su estado original. Los métodos para lograr esta vitrificación incluyen la congelación rápida en etano líquido y la congelación a alta presión.A partir de esta técnica se ha derivadotodo un campo llamado microscopía crioelectrónica . Con el desarrollo de la microscopía crioelectrónica de secciones vítreas (CEMOVIS) [42] yel fresado crioenfocado de laminillas con haz de iones [43] , ahora es posible observar muestras de prácticamente cualquier espécimen biológico cercano a su estado nativo.
Inclusión de muestras biológicas : después de la deshidratación, el tejido para su observación en el microscopio electrónico de transmisión se incrusta para que pueda seccionarse y estar listo para su visualización. Para hacer esto, el tejido se pasa a través de un "disolvente de transición" como óxido de propileno (epoxipropano) o acetona y luego se infiltra con una resina epoxi como Araldite , Epon o Durcupan ; [44] los pañuelos también se pueden incrustar directamente en resina acrílica miscible en agua . Una vez que la resina se ha polimerizado (endurecido), la muestra se secciona mediante ultramicrotomía y se tiñe . [ cita necesaria ]
Incrustación, materiales : después de incrustarla en resina, la muestra generalmente se muele y se pule hasta obtener un acabado similar a un espejo utilizando abrasivos ultrafinos. [ cita necesaria ]
Fractura por congelación o grabado por congelación : un método de preparación [45] [46] [47] particularmente útil para examinar las membranas lipídicas y sus proteínas incorporadas en vista "de frente". [48] [49] [50]La liofilización ayuda a despegar las membranas abiertas para permitir la visualización de lo que hay en su interior.Cara externa de la membrana de levadura de panadería que muestra los pequeños orificios donde se fracturan las proteínas, a veces como pequeños patrones de anillos.El tejido fresco o la suspensión celular se congela rápidamente (criofijación) y luego se fractura rompiéndolo [51] (o usando un micrótomo) [50] mientras se mantiene a la temperatura del nitrógeno líquido. La superficie fría fracturada (a veces "grabada" aumentando la temperatura a aproximadamente -100 °C durante varios minutos para dejar que algo de hielo se sublime) [50] luego se sombrea con platino u oro evaporado en un ángulo promedio de 45 ° en alto vacío. evaporador. La segunda capa de carbono, evaporada perpendicular al plano superficial medio, a menudo se aplica para mejorar la estabilidad del recubrimiento de réplica. La muestra se devuelve a temperatura y presión ambiente, luego la extremadamente frágil réplica metálica "pre-sombreada" de la superficie de la fractura se libera del material biológico subyacente mediante una cuidadosa digestión química con ácidos, solución de hipoclorito o detergente SDS . La réplica aún flotante se lava minuciosamente para eliminar productos químicos residuales, se pesca cuidadosamente sobre rejillas finas, se seca y luego se observa en el TEM. [ cita necesaria ]
Marcado con inmunooro de réplica de fractura por congelación (FRIL) : el método de fractura por congelación se ha modificado para permitir la identificación de los componentes de la cara de la fractura mediante etiquetado con inmunooro. En lugar de eliminar todo el tejido subyacente de la réplica descongelada como paso final antes de observarlo en el microscopio, el grosor del tejido se minimiza durante o después del proceso de fractura. La fina capa de tejido permanece unida a la réplica metálica para que pueda marcarse con inmunooro con anticuerpos contra las estructuras elegidas. La fina capa del espécimen original sobre la réplica con oro adherido permite la identificación de estructuras en el plano de fractura. [52] También existen métodos relacionados que etiquetan la superficie de las células grabadas [53] y otras variaciones de etiquetado de réplicas. [54]
Molienda por haz de iones : adelgaza las muestras hasta que sean transparentes a los electrones disparando iones (normalmente argón ) a la superficie desde un ángulo y pulverizando material desde la superficie. Una subclase de esto es la molienda con haz de iones enfocados , donde los iones de galio se utilizan para producir una membrana o "laminilla" transparente a los electrones en una región específica de la muestra, por ejemplo a través de un dispositivo dentro de un microprocesador o un SEM con haz de iones enfocado . La molienda con haz de iones también se puede utilizar para el pulido de secciones transversales antes del análisis de materiales que son difíciles de preparar mediante pulido mecánico. [ cita necesaria ]
Tinción negativa : las suspensiones que contienen nanopartículas o material biológico fino (como virus y bacterias) se mezclan brevemente con una solución diluida de una solución opaca a los electrones, como molibdato de amonio, acetato (o formiato) de uranilo o ácido fosfotúngstico . [ cita necesaria ] Esta mezcla se aplica a una rejilla EM, se recubre previamente con una película plástica como formvar, se seca y luego se deja secar. La visualización de esta preparación en el TEM debe realizarse sin demora para obtener mejores resultados. El método es importante en microbiología para una identificación morfológica rápida pero cruda, pero también puede usarse como base para la reconstrucción 3D de alta resolución utilizando la metodología de tomografía EM cuando se utilizan películas de carbono como soporte.
Seccionamiento : produce rodajas finas de la muestra, semitransparentes a los electrones. Estos se pueden cortar mediante ultramicrotomía en un ultramicrótomo con un cuchillo de vidrio o de diamante para producir secciones ultrafinas de aproximadamente 60 a 90 nm de espesor. También se utilizan cuchillos de vidrio desechables porque se pueden fabricar en el laboratorio y son mucho más económicos. Las secciones también se pueden crear in situ fresando en un SEM con haz de iones enfocado , donde la sección se conoce como laminilla. [43]
Tinción : utiliza metales pesados como plomo , uranio o tungsteno para dispersar electrones de imágenes y así dar contraste entre diferentes estructuras, ya que muchos materiales (especialmente biológicos) son casi "transparentes" a los electrones (objetos de fase débil). En biología, las muestras se pueden teñir "en bloque" antes de incrustarlas y también más tarde después de seccionarlas. Normalmente, las secciones delgadas se tiñen durante varios minutos con una solución acuosa o alcohólica de acetato de uranilo seguido de citrato de plomo acuoso. [55]
Flujos de trabajo de EM
En sus configuraciones más comunes, los microscopios electrónicos producen imágenes con un único valor de brillo por píxel, y los resultados generalmente se representan en escala de grises . [56] Sin embargo, a menudo estas imágenes se colorean mediante el uso de software de detección de características o simplemente editándolas manualmente con un editor de gráficos. Esto se puede hacer para aclarar la estructura o por un efecto estético y generalmente no agrega información nueva sobre la muestra. [57]
Los microscopios electrónicos ahora se utilizan con frecuencia en flujos de trabajo más complejos, y cada flujo de trabajo suele utilizar múltiples tecnologías para permitir análisis más complejos y/o más cuantitativos de una muestra. A continuación se describen algunos ejemplos, pero no debe considerarse una lista exhaustiva. La elección del flujo de trabajo dependerá en gran medida de la aplicación y los requisitos de las preguntas científicas correspondientes, como la resolución, el volumen, la naturaleza de la molécula objetivo, etc.
Por ejemplo, se pueden superponer imágenes de microscopía óptica y electrónica de la misma región de una muestra para correlacionar los datos de las dos modalidades. Esto se usa comúnmente para proporcionar información EM contextual de mayor resolución sobre una estructura marcada con fluorescencia. Esta microscopía óptica y electrónica correlativa ( CLEM ) [58] es uno de una variedad de flujos de trabajo correlativos disponibles ahora. Otro ejemplo es la espectrometría de masas de alta resolución (microscopía iónica), que se ha utilizado para proporcionar información correlativa sobre la localización subcelular de antibióticos, [59] datos que serían difíciles de obtener por otros medios.
El papel inicial de los microscopios electrónicos en la obtención de imágenes de cortes bidimensionales (TEM) o de la superficie de una muestra (SEM con electrones secundarios) también se ha expandido cada vez más hacia la profundidad de las muestras. [60] Un ejemplo temprano de estos flujos de trabajo de 'Volumen EM' fue simplemente apilar imágenes TEM de secciones en serie cortadas a través de una muestra. El siguiente desarrollo fue la reconstrucción virtual de un volumen de sección gruesa (200-500 nm) mediante retroproyección de un conjunto de imágenes tomadas con diferentes ángulos de inclinación: tomografía TEM . [61]
Imágenes en serie para volumen EM
Para adquirir conjuntos de datos EM de volumen de profundidades mayores que la tomografía TEM (micrómetros o milímetros en el eje z), se puede utilizar una serie de imágenes tomadas a través de la profundidad de la muestra. Por ejemplo, se pueden obtener imágenes de cintas de secciones en serie en un TEM como se describió anteriormente, y cuando se usan secciones más gruesas, se puede usar una tomografía TEM en serie para aumentar la resolución z. Más recientemente, se pueden adquirir imágenes de electrones retrodispersados (BSE) de una serie más grande de secciones recolectadas en obleas de silicio, lo que se conoce como tomografía de matriz SEM. [62] [63] Un enfoque alternativo es utilizar BSE SEM para obtener imágenes de la superficie del bloque en lugar de la sección, después de que se haya eliminado cada sección. Mediante este método, un ultramicrótomo instalado en una cámara SEM puede aumentar la automatización del flujo de trabajo; el bloque de muestra se carga en la cámara y el sistema se programa para cortar y obtener imágenes continuamente de la muestra. Esto se conoce como SEM de cara de bloque en serie. [64] Un método relacionado utiliza fresado con haz de iones enfocado en lugar de un ultramicrótomo para eliminar secciones. En estos métodos de imágenes en serie, la salida es esencialmente una secuencia de imágenes a través de un bloque de muestra que puede alinearse digitalmente en secuencia y así reconstruirse en un conjunto de datos EM de volumen. El mayor volumen disponible en estos métodos ha ampliado la capacidad de la microscopía electrónica para abordar nuevas cuestiones, [60] como el mapeo de la conectividad neuronal en el cerebro, [65] y los sitios de contacto de las membranas entre orgánulos. [66]
Los microscopios electrónicos son costosos de construir y mantener. Los microscopios diseñados para alcanzar altas resoluciones deben alojarse en edificios estables (a veces subterráneos) con servicios especiales, como sistemas de cancelación de campos magnéticos. [67]
Los microscopios electrónicos de barrido que funcionan en modo convencional de alto vacío suelen obtener imágenes de muestras conductoras; por lo tanto, los materiales no conductores requieren un recubrimiento conductor (aleación de oro/paladio, carbono, osmio, etc.). El modo de bajo voltaje de los microscopios modernos hace posible la observación de muestras no conductoras sin recubrimiento. Los materiales no conductores también pueden obtenerse imágenes mediante un microscopio electrónico de barrido de presión variable (o ambiental). [ cita necesaria ]
Las muestras pequeñas y estables, como los nanotubos de carbono , los frústulos de diatomeas y los pequeños cristales minerales (fibras de amianto, por ejemplo), no requieren ningún tratamiento especial antes de ser examinados en el microscopio electrónico. Las muestras de materiales hidratados, incluidas casi todas las muestras biológicas, deben prepararse de diversas formas para estabilizarlas, reducir su espesor (corte ultrafino) y aumentar su contraste óptico electrónico (tinción). Estos procesos pueden dar lugar a artefactos , pero normalmente pueden identificarse comparando los resultados obtenidos utilizando métodos de preparación de muestras radicalmente diferentes. Desde la década de 1980, los científicos también han utilizado cada vez más el análisis de muestras vitrificadas y criofijadas , lo que confirma aún más la validez de esta técnica. [70] [71] [72]
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