Un microscopio (del griego antiguo μικρός ( mikrós ) 'pequeño' y σκοπέω ( skopéō ) 'mirar (a); examinar, inspeccionar') es un instrumento de laboratorio que se utiliza para examinar objetos que son demasiado pequeños para ser vistos a simple vista . La microscopía es la ciencia de investigar objetos y estructuras pequeñas utilizando un microscopio. Microscópico significa invisible al ojo a menos que se utilice un microscopio.
Existen muchos tipos de microscopios y se pueden agrupar de diferentes maneras. Una forma es describir el método que utiliza un instrumento para interactuar con una muestra y producir imágenes, ya sea enviando un haz de luz o electrones a través de una muestra en su trayectoria óptica , detectando emisiones de fotones de una muestra o escaneando a través y a una corta distancia de la superficie de una muestra utilizando una sonda. El microscopio más común (y el primero en inventarse) es el microscopio óptico , que utiliza lentes para refractar la luz visible que pasa a través de una muestra seccionada finamente para producir una imagen observable. Otros tipos importantes de microscopios son el microscopio de fluorescencia , el microscopio electrónico (tanto el microscopio electrónico de transmisión como el microscopio electrónico de barrido ) y varios tipos de microscopios de sonda de barrido . [1]
Aunque los objetos que se asemejan a lentes datan de hace 4.000 años y hay relatos griegos de las propiedades ópticas de esferas llenas de agua (siglo V a. C.) seguidos de muchos siglos de escritos sobre óptica, el primer uso conocido de microscopios simples ( lupas ) se remonta al uso generalizado de lentes en anteojos en el siglo XIII. [2] [3] [4] Los primeros ejemplos conocidos de microscopios compuestos, que combinan una lente objetivo cerca de la muestra con un ocular para ver una imagen real , aparecieron en Europa alrededor de 1620. [5] Se desconoce el inventor, aunque se han hecho muchas afirmaciones a lo largo de los años. Varios giran en torno a los centros de fabricación de gafas en los Países Bajos , incluidas las afirmaciones de que fue inventado en 1590 por Zacharias Janssen (afirmación hecha por su hijo) o el padre de Zacharias, Hans Martens, o ambos, [6] [7] afirma que fue inventado por su vecino y rival fabricante de gafas, Hans Lippershey (que solicitó la primera patente de telescopio en 1608), [8] y afirma que fue inventado por el expatriado Cornelis Drebbel , que se destacó por tener una versión en Londres en 1619. [9] [10] Galileo Galilei (también citado a veces como inventor del microscopio compuesto) parece haber descubierto después de 1610 que podía enfocar de cerca su telescopio para ver objetos pequeños y, después de ver un microscopio compuesto construido por Drebbel exhibido en Roma en 1624, construyó su propia versión mejorada. [11] [12] [13] Giovanni Faber acuñó el nombre de microscopio para el microscopio compuesto que Galileo presentó a la Accademia dei Lincei en 1625 [14] (Galileo lo había llamado occhiolino 'pequeño ojo'). René Descartes ( Dioptrique , 1637) describe microscopios en los que se utiliza un espejo cóncavo, con su concavidad hacia el objeto, junto con una lente, para iluminar el objeto, que está montado en un punto que lo fija en el foco del espejo. [15]
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El primer relato detallado de la anatomía microscópica del tejido orgánico basado en el uso de un microscopio no apareció hasta 1644, en L'occhio della mosca , o El ojo de la mosca , de Giambattista Odierna . [16]
El microscopio fue en gran medida una novedad hasta las décadas de 1660 y 1670, cuando los naturalistas de Italia, los Países Bajos e Inglaterra comenzaron a usarlos para estudiar biología. El científico italiano Marcello Malpighi , llamado el padre de la histología por algunos historiadores de la biología, comenzó su análisis de las estructuras biológicas con los pulmones. La publicación en 1665 de Micrographia de Robert Hooke tuvo un gran impacto, en gran parte debido a sus impresionantes ilustraciones. Hooke creó diminutas lentes de pequeños glóbulos de vidrio hechos fusionando los extremos de hilos de vidrio hilado. [15] Una contribución significativa provino de Antonie van Leeuwenhoek , quien logró un aumento de hasta 300 veces usando un microscopio simple de una sola lente. Colocó una lente de bola de vidrio muy pequeña entre los orificios de dos placas de metal remachadas juntas, y con una aguja ajustable por tornillos unida para montar la muestra. [17] Luego, Van Leeuwenhoek redescubrió los glóbulos rojos (después de Jan Swammerdam ) y los espermatozoides , y ayudó a popularizar el uso de microscopios para observar la ultraestructura biológica. El 9 de octubre de 1676, van Leeuwenhoek informó sobre el descubrimiento de los microorganismos. [16]
El rendimiento de un microscopio óptico compuesto depende de la calidad y el uso correcto del sistema de lentes condensadoras para enfocar la luz en la muestra y de la lente objetivo para capturar la luz de la muestra y formar una imagen. [5] Los primeros instrumentos eran limitados hasta que este principio se apreció y desarrolló por completo desde finales del siglo XIX hasta principios del siglo XX, y hasta que las lámparas eléctricas estuvieron disponibles como fuentes de luz. En 1893, August Köhler desarrolló un principio clave de iluminación de muestras, la iluminación de Köhler , que es fundamental para lograr los límites teóricos de resolución para el microscopio óptico. Este método de iluminación de muestras produce una iluminación uniforme y supera el contraste y la resolución limitados impuestos por las primeras técnicas de iluminación de muestras. Los desarrollos posteriores en la iluminación de muestras vinieron del descubrimiento del contraste de fase por Frits Zernike en 1953 y la iluminación de contraste de interferencia diferencial por Georges Nomarski en 1955; ambos permiten obtener imágenes de muestras transparentes sin teñir.
A principios del siglo XX se desarrolló una alternativa significativa al microscopio óptico, un instrumento que utiliza un haz de electrones en lugar de luz para generar una imagen. El físico alemán Ernst Ruska , en colaboración con el ingeniero eléctrico Max Knoll , desarrolló el primer prototipo de microscopio electrónico en 1931, un microscopio electrónico de transmisión (MET). El microscopio electrónico de transmisión funciona con principios similares a los de un microscopio óptico, pero utiliza electrones en lugar de luz y electroimanes en lugar de lentes de vidrio. El uso de electrones, en lugar de luz, permite una resolución mucho mayor.
El desarrollo del microscopio electrónico de transmisión fue rápidamente seguido en 1935 por el desarrollo del microscopio electrónico de barrido por Max Knoll . [18] Aunque los TEM se utilizaban para investigación antes de la Segunda Guerra Mundial y se hicieron populares después, el SEM no estuvo disponible comercialmente hasta 1965.
Los microscopios electrónicos de transmisión se hicieron populares después de la Segunda Guerra Mundial . Ernst Ruska, que trabajaba en Siemens , desarrolló el primer microscopio electrónico de transmisión comercial y, en la década de 1950, comenzaron a celebrarse importantes conferencias científicas sobre microscopía electrónica. En 1965, el profesor Sir Charles Oatley y su estudiante de posgrado Gary Stewart desarrollaron el primer microscopio electrónico de barrido comercial y lo comercializaron la Cambridge Instrument Company con el nombre de "Stereoscan".
Uno de los últimos descubrimientos realizados sobre el uso de un microscopio electrónico es la capacidad de identificar un virus. [19] Dado que este microscopio produce una imagen visible y clara de pequeños orgánulos, en un microscopio electrónico no hay necesidad de reactivos para ver el virus o las células dañinas, lo que resulta en una forma más eficiente de detectar patógenos.
De 1981 a 1983, Gerd Binnig y Heinrich Rohrer trabajaron en IBM en Zúrich , Suiza, para estudiar el fenómeno del efecto túnel cuántico . Crearon un instrumento práctico, un microscopio de sonda de barrido a partir de la teoría del efecto túnel cuántico, que leía fuerzas muy pequeñas intercambiadas entre una sonda y la superficie de una muestra. La sonda se acerca a la superficie tan de cerca que los electrones pueden fluir continuamente entre la sonda y la muestra, creando una corriente de la superficie a la sonda. El microscopio no fue bien recibido inicialmente debido a la naturaleza compleja de las explicaciones teóricas subyacentes. En 1984, Jerry Tersoff y DR Hamann, mientras estaban en los Laboratorios Bell de AT&T en Murray Hill, Nueva Jersey, comenzaron a publicar artículos que vinculaban la teoría con los resultados experimentales obtenidos por el instrumento. Esto fue seguido de cerca en 1985 con instrumentos comerciales en funcionamiento, y en 1986 con la invención del microscopio de fuerza atómica por parte de Gerd Binnig, Quate y Gerber , luego el Premio Nobel de Física de Binnig y Rohrer por el SPM. [20]
Se han seguido desarrollando nuevos tipos de microscopios de sonda de barrido a medida que ha avanzado la capacidad de mecanizar sondas y puntas ultrafinas.
Los desarrollos más recientes en microscopio óptico se centran en gran medida en el auge de la microscopía de fluorescencia en biología . [21] Durante las últimas décadas del siglo XX, particularmente en la era postgenómica, se desarrollaron muchas técnicas para la tinción fluorescente de estructuras celulares. [ 21 ] Los principales grupos de técnicas implican la tinción química dirigida de estructuras celulares particulares, por ejemplo, el compuesto químico DAPI para marcar el ADN , el uso de anticuerpos conjugados con reporteros fluorescentes, ver inmunofluorescencia , y proteínas fluorescentes, como la proteína fluorescente verde . [22] Estas técnicas utilizan estos diferentes fluoróforos para el análisis de la estructura celular a nivel molecular en muestras vivas y fijadas.
El auge de la microscopía de fluorescencia impulsó el desarrollo de un importante diseño de microscopio moderno, el microscopio confocal . El principio fue patentado en 1957 por Marvin Minsky , aunque la tecnología láser limitó la aplicación práctica de la técnica. No fue hasta 1978 cuando Thomas y Christoph Cremer desarrollaron el primer microscopio láser de barrido confocal práctico y la técnica ganó popularidad rápidamente durante la década de 1980.
Gran parte de la investigación actual (a principios del siglo XXI) sobre técnicas de microscopio óptico se centra en el desarrollo de análisis de superresolución de muestras marcadas con fluorescencia. La iluminación estructurada puede mejorar la resolución entre dos y cuatro veces y técnicas como la microscopía de agotamiento de emisión estimulada (STED) se están acercando a la resolución de los microscopios electrónicos. [23] Esto ocurre porque el límite de difracción se produce a partir de la luz o la excitación, lo que hace que la resolución deba duplicarse para llegar a la supersaturación. Stefan Hell recibió el Premio Nobel de Química 2014 por el desarrollo de la técnica STED, junto con Eric Betzig y William Moerner, quienes adaptaron la microscopía de fluorescencia para la visualización de moléculas individuales. [24]
Los microscopios de rayos X son instrumentos que utilizan radiación electromagnética, generalmente en la banda de rayos X suaves, para obtener imágenes de objetos. Los avances tecnológicos en la óptica de lentes de rayos X a principios de la década de 1970 hicieron que el instrumento fuera una opción viable para la obtención de imágenes. [25] A menudo se utilizan en tomografía (ver microtomografía computarizada ) para producir imágenes tridimensionales de objetos, incluidos materiales biológicos que no han sido fijados químicamente. Actualmente se están realizando investigaciones para mejorar la óptica para rayos X duros que tienen un mayor poder de penetración. [25]
Los microscopios se pueden clasificar en varias clases diferentes. Una de ellas se basa en lo que interactúa con la muestra para generar la imagen, es decir, luz o fotones (microscopios ópticos), electrones (microscopios electrónicos) o una sonda (microscopios de sonda de barrido). Alternativamente, los microscopios se pueden clasificar en función de si analizan la muestra a través de un punto de barrido (microscopios ópticos confocales, microscopios electrónicos de barrido y microscopios de sonda de barrido) o si analizan la muestra de una sola vez (microscopios ópticos de campo amplio y microscopios electrónicos de transmisión).
Tanto los microscopios ópticos de campo amplio como los microscopios electrónicos de transmisión utilizan la teoría de lentes ( óptica para microscopios ópticos y lentes electromagnéticas para microscopios electrónicos) para ampliar la imagen generada por el paso de una onda transmitida a través de la muestra, o reflejada por la muestra. Las ondas utilizadas son electromagnéticas (en microscopios ópticos ) o haces de electrones (en microscopios electrónicos ). La resolución en estos microscopios está limitada por la longitud de onda de la radiación utilizada para obtener la imagen de la muestra, donde las longitudes de onda más cortas permiten una resolución más alta. [21]
Los microscopios ópticos y electrónicos de barrido, como el microscopio confocal y el microscopio electrónico de barrido, utilizan lentes para enfocar un punto de luz o electrones sobre la muestra y luego analizar las señales generadas por el haz que interactúa con la muestra. Luego, el punto se escanea sobre la muestra para analizar una región rectangular. La ampliación de la imagen se logra mostrando los datos del escaneo de un área de muestra físicamente pequeña en una pantalla relativamente grande. Estos microscopios tienen el mismo límite de resolución que los microscopios ópticos, de sonda y electrónicos de campo amplio.
Los microscopios de sonda de barrido también analizan un único punto de la muestra y luego escanean una región rectangular de la muestra para crear una imagen. Como estos microscopios no utilizan radiación electromagnética o electrónica para la obtención de imágenes, no están sujetos al mismo límite de resolución que los microscopios ópticos y electrónicos descritos anteriormente.
El tipo más común de microscopio (y el primero inventado) es el microscopio óptico . Este es un instrumento óptico que contiene una o más lentes que producen una imagen ampliada de una muestra colocada en el plano focal. Los microscopios ópticos tienen vidrio refractivo (ocasionalmente plástico o cuarzo ), para enfocar la luz en el ojo o en otro detector de luz. Los microscopios ópticos basados en espejos funcionan de la misma manera. El aumento típico de un microscopio óptico, asumiendo luz de rango visible, es de hasta 1250× con un límite de resolución teórico de alrededor de 0,250 micrómetros o 250 nanómetros . [21] Esto limita el aumento práctico a ~1500×. Las técnicas especializadas (por ejemplo, microscopía confocal de barrido , Vertico SMI ) pueden superar este aumento, pero la resolución está limitada por difracción . El uso de longitudes de onda de luz más cortas, como la ultravioleta, es una forma de mejorar la resolución espacial del microscopio óptico, al igual que dispositivos como el microscopio óptico de barrido de campo cercano .
Sarfus es una técnica óptica reciente que aumenta la sensibilidad de un microscopio óptico estándar hasta el punto de permitir la visualización directa de películas nanométricas (hasta 0,3 nanómetros) y nanoobjetos aislados (hasta 2 nm de diámetro). La técnica se basa en el uso de sustratos no reflectantes para la microscopía de luz reflejada con polarización cruzada.
La luz ultravioleta permite la resolución de características microscópicas, así como la obtención de imágenes de muestras que son transparentes para el ojo. La luz infrarroja cercana se puede utilizar para visualizar circuitos integrados en dispositivos de silicio unidos, ya que el silicio es transparente en esta región de longitudes de onda.
En la microscopía de fluorescencia se pueden utilizar muchas longitudes de onda de luz, desde el ultravioleta hasta el visible, para provocar que las muestras emitan fluorescencia , lo que permite su visualización a simple vista o con cámaras específicamente sensibles.
La microscopía de contraste de fases es una técnica de iluminación microscópica óptica en la que pequeños cambios de fase en la luz que pasa a través de una muestra transparente se convierten en cambios de amplitud o contraste en la imagen. [21] El uso del contraste de fases no requiere tinción para ver el portaobjetos. Esta técnica de microscopio hizo posible estudiar el ciclo celular en células vivas.
El microscopio óptico tradicional ha evolucionado más recientemente hacia el microscopio digital . Además de, o en lugar de, ver directamente el objeto a través de los oculares , se utiliza un tipo de sensor similar a los que se utilizan en una cámara digital para obtener una imagen, que luego se muestra en un monitor de computadora. Estos sensores pueden utilizar tecnología CMOS o de dispositivo acoplado a carga (CCD), según la aplicación.
La microscopía digital con niveles de luz muy bajos para evitar dañar las muestras biológicas vulnerables está disponible utilizando cámaras digitales sensibles de conteo de fotones . Se ha demostrado que una fuente de luz que proporcione pares de fotones entrelazados puede minimizar el riesgo de daño a las muestras más sensibles a la luz. En esta aplicación de imágenes fantasma a la microscopía de fotones dispersos, la muestra se ilumina con fotones infrarrojos, cada uno de los cuales está correlacionado espacialmente con un compañero entrelazado en la banda visible para obtener imágenes eficientes mediante una cámara de conteo de fotones. [27]
Los dos tipos principales de microscopios electrónicos son los microscopios electrónicos de transmisión (MET) y los microscopios electrónicos de barrido (MEB). [21] [22] Ambos tienen una serie de lentes electromagnéticas y electrostáticas para enfocar un haz de electrones de alta energía sobre una muestra. En un MET, los electrones pasan a través de la muestra, de manera análoga a la microscopía óptica básica . [21] Esto requiere una preparación cuidadosa de la muestra, ya que los electrones se dispersan fuertemente por la mayoría de los materiales. [22] Las muestras también deben ser muy delgadas (por debajo de 100 nm) para que los electrones pasen a través de ellas. [21] [22] Las secciones transversales de células teñidas con osmio y metales pesados revelan membranas de orgánulos claras y proteínas como los ribosomas. [22] Con un nivel de resolución de 0,1 nm, se pueden obtener vistas detalladas de virus (20 – 300 nm) y una cadena de ADN (2 nm de ancho). [22] Por el contrario, el SEM tiene bobinas de trama para escanear la superficie de objetos voluminosos con un haz de electrones fino. Por lo tanto, no es necesario seccionar necesariamente la muestra, pero puede ser necesario recubrirla con una capa nanométrica de metal o carbono para muestras no conductoras. [21] El SEM permite obtener imágenes rápidas de la superficie de las muestras, posiblemente en vapor de agua fino para evitar que se sequen. [21] [22]
Los diferentes tipos de microscopios de sonda de barrido surgen de los muchos tipos diferentes de interacciones que ocurren cuando una sonda pequeña se escanea e interactúa con una muestra. Estas interacciones o modos se pueden registrar o mapear en función de la ubicación en la superficie para formar un mapa de caracterización. Los tres tipos más comunes de microscopios de sonda de barrido son los microscopios de fuerza atómica (AFM), los microscopios ópticos de barrido de campo cercano (NSOM o SNOM, microscopía óptica de barrido de campo cercano) y los microscopios de efecto túnel de barrido (STM). [28] Un microscopio de fuerza atómica tiene una sonda fina, generalmente de silicio o nitruro de silicio, unida a un voladizo; la sonda se escanea sobre la superficie de la muestra y se miden y mapean las fuerzas que causan una interacción entre la sonda y la superficie de la muestra. Un microscopio óptico de barrido de campo cercano es similar a un AFM, pero su sonda consiste en una fuente de luz en una fibra óptica cubierta con una punta que generalmente tiene una abertura para que pase la luz. El microscopio puede capturar luz transmitida o reflejada para medir propiedades ópticas muy localizadas de la superficie, generalmente de una muestra biológica. Los microscopios de efecto túnel tienen una punta de metal con un solo átomo apical; la punta está unida a un tubo a través del cual fluye una corriente. [29] La punta se escanea sobre la superficie de una muestra conductora hasta que fluye una corriente de efecto túnel; la corriente se mantiene constante mediante el movimiento de la punta por computadora y se forma una imagen mediante los movimientos registrados de la punta. [28]
Los microscopios acústicos de barrido utilizan ondas sonoras para medir las variaciones de impedancia acústica. En principio, son similares a los sonares y se utilizan para detectar defectos en las superficies de los materiales, incluidos los que se encuentran en los circuitos integrados. El 4 de febrero de 2013, ingenieros australianos construyeron un "microscopio cuántico" que proporciona una precisión sin igual. [30]
Los microscopios de aplicaciones móviles se pueden utilizar opcionalmente como microscopios ópticos cuando se activa la linterna. Sin embargo, los microscopios de aplicaciones móviles son más difíciles de usar debido al ruido visual , suelen estar limitados a 40x y a los límites de resolución de la propia lente de la cámara .
