La microscopía de fuerza atómica ( AFM ) o microscopía de fuerza de barrido ( SFM ) es un tipo de microscopía de sonda de barrido (SPM) de muy alta resolución, con una resolución demostrada del orden de fracciones de un nanómetro, más de 1000 veces mejor que el límite de difracción óptica .
La microscopía de fuerza atómica [1] (AFM) es un tipo de microscopio de fuerza atómica (SPM), con una resolución demostrada del orden de fracciones de nanómetro, más de 1000 veces mejor que el límite de difracción óptica . La información se obtiene "sintiendo" o "tocando" la superficie con una sonda mecánica. Los elementos piezoeléctricos que facilitan movimientos minúsculos pero precisos y exactos bajo comando (electrónico) permiten un escaneo preciso. A pesar del nombre, el microscopio de fuerza atómica no utiliza la fuerza nuclear .
El AFM tiene tres capacidades principales: medición de fuerza, imágenes topográficas y manipulación.
En la medición de fuerza, los AFM se pueden utilizar para medir las fuerzas entre la sonda y la muestra en función de su separación mutua. Esto se puede aplicar para realizar espectroscopia de fuerza , para medir las propiedades mecánicas de la muestra, como el módulo de Young de la muestra , una medida de rigidez.
Para la obtención de imágenes, la reacción de la sonda a las fuerzas que la muestra le impone se puede utilizar para formar una imagen de la forma tridimensional (topografía) de la superficie de una muestra con una alta resolución. Esto se logra escaneando la posición de la muestra con respecto a la punta y registrando la altura de la sonda que corresponde a una interacción constante entre la sonda y la muestra (consulte el § Imagen topográfica para obtener más información). La topografía de la superficie se muestra comúnmente como un gráfico de pseudocolor .
Aunque la publicación inicial sobre microscopía de fuerza atómica por Binnig, Quate y Gerber en 1986 especulaba sobre la posibilidad de lograr resolución atómica, se necesitaban superar profundos desafíos experimentales antes de que la resolución atómica de defectos y bordes de paso en condiciones ambientales (líquidas) fuera demostrada en 1993 por Ohnesorge y Binnig. [2] La verdadera resolución atómica de la superficie de silicio 7x7 (las imágenes atómicas de esta superficie obtenidas por STM habían convencido a la comunidad científica de la espectacular resolución espacial de la microscopía de efecto túnel de barrido) tuvo que esperar un poco más antes de que Giessibl la demostrara. [3] La resolución subatómica (es decir, la capacidad de resolver detalles estructurales dentro de la densidad electrónica de un solo átomo) también se ha logrado mediante AFM.
En la manipulación, las fuerzas entre la punta y la muestra también se pueden utilizar para cambiar las propiedades de la muestra de forma controlada. Algunos ejemplos de esto incluyen la manipulación atómica, la litografía con sonda de barrido y la estimulación local de células.
Simultáneamente con la adquisición de imágenes topográficas, se pueden medir localmente otras propiedades de la muestra y visualizarlas como una imagen, a menudo con una resolución igualmente alta. Ejemplos de tales propiedades son propiedades mecánicas como la rigidez o la fuerza de adhesión y propiedades eléctricas como la conductividad o el potencial de superficie. [4] De hecho, la mayoría de las técnicas de SPM son extensiones de AFM que utilizan esta modalidad. [5]
La principal diferencia entre la microscopía de fuerza atómica y las tecnologías de la competencia, como la microscopía óptica y la microscopía electrónica, es que la AFM no utiliza lentes ni irradiación con rayos. Por lo tanto, no sufre limitaciones en la resolución espacial debido a la difracción y la aberración, y no es necesario preparar un espacio para guiar el rayo (creando un vacío) ni teñir la muestra.
Existen varios tipos de microscopía de barrido, incluida la SPM (que incluye AFM, microscopía de efecto túnel de barrido (STM) y microscopio óptico de barrido de campo cercano (SNOM/NSOM), microscopía STED (STED) y microscopía electrónica de barrido y AFM electroquímico , EC-AFM). Aunque SNOM y STED utilizan luz visible , infrarroja o incluso de terahercios para iluminar la muestra, su resolución no está limitada por el límite de difracción.
La figura 3 muestra un AFM, que normalmente consta de las siguientes características. [6] Los números entre paréntesis corresponden a las características numeradas en la figura 3. Las direcciones de las coordenadas están definidas por el sistema de coordenadas (0).
El pequeño voladizo (1) en forma de resorte es soportado por el soporte (2). Opcionalmente, un elemento piezoeléctrico (normalmente hecho de un material cerámico) (3) hace oscilar el voladizo (1). La punta afilada (4) está fijada al extremo libre del voladizo (1). El detector (5) registra la deflexión y el movimiento del voladizo (1). La muestra (6) está montada en la platina de muestra (8). Un accionamiento xyz (7) permite desplazar la muestra (6) y la platina de muestra (8) en las direcciones x, y y z con respecto al vértice de la punta (4). Aunque la Fig. 3 muestra el accionamiento unido a la muestra, el accionamiento también puede estar unido a la punta, o pueden estar unidos accionamientos independientes a ambos, ya que es el desplazamiento relativo de la muestra y la punta lo que se necesita controlar. Los controladores y el trazador no se muestran en la Fig. 3.
Según la configuración descrita anteriormente, la interacción entre la punta y la muestra, que puede ser un fenómeno a escala atómica, se traduce en cambios en el movimiento de la ménsula, que es un fenómeno a escala macro. Se pueden utilizar varios aspectos diferentes del movimiento de la ménsula para cuantificar la interacción entre la punta y la muestra, más comúnmente el valor de la deflexión, la amplitud de una oscilación impuesta de la ménsula o el cambio en la frecuencia de resonancia de la ménsula (consulte la sección Modos de obtención de imágenes).
El detector (5) del AFM mide la deflexión (desplazamiento respecto a la posición de equilibrio) del cantilever y la convierte en una señal eléctrica. La intensidad de esta señal será proporcional al desplazamiento del cantilever.
Se pueden utilizar varios métodos de detección, por ejemplo, interferometría, palancas ópticas, el método piezoeléctrico y detectores basados en STM (consulte la sección "Medición de la deflexión del voladizo AFM").
Esta sección se aplica específicamente a la obtención de imágenes en el modo de contacto. Para otros modos de obtención de imágenes, el proceso es similar, excepto que la "deflexión" debe reemplazarse por la variable de retroalimentación adecuada.
Cuando se utiliza el AFM para obtener imágenes de una muestra, la punta se pone en contacto con la muestra y la muestra se escanea a lo largo de una cuadrícula x-y (fig. 4). Lo más común es que se emplee un bucle de retroalimentación electrónico para mantener constante la fuerza entre la sonda y la muestra durante el escaneo. Este bucle de retroalimentación tiene como entrada la deflexión del voladizo y su salida controla la distancia a lo largo del eje z entre el soporte de la sonda (2 en la fig. 3) y el soporte de la muestra (8 en la fig. 3). Mientras la punta permanezca en contacto con la muestra y la muestra se escanee en el plano x-y, las variaciones de altura en la muestra cambiarán la deflexión del voladizo. La retroalimentación luego ajusta la altura del soporte de la sonda de modo que la deflexión se restablezca a un valor definido por el usuario (el punto de ajuste). Un bucle de retroalimentación ajustado correctamente ajusta la separación entre el soporte y la muestra de manera continua durante el movimiento de escaneo, de modo que la deflexión permanezca aproximadamente constante. En esta situación, la salida de retroalimentación es igual a la topografía de la superficie de la muestra con un pequeño margen de error.
Históricamente, se ha utilizado un método de operación diferente, en el que la distancia de soporte de la muestra y la sonda se mantiene constante y no se controla mediante una retroalimentación ( mecanismo servo ). En este modo, generalmente denominado "modo de altura constante", la desviación del voladizo se registra como una función de la posición x–y de la muestra. Mientras la punta esté en contacto con la muestra, la desviación corresponde a la topografía de la superficie. Este método ahora se usa con menos frecuencia porque las fuerzas entre la punta y la muestra no están controladas, lo que puede generar fuerzas lo suficientemente altas como para dañar la punta o la muestra. [ cita requerida ] Sin embargo, es una práctica común registrar la desviación incluso cuando se escanea en modo de fuerza constante, con retroalimentación. Esto revela el pequeño error de seguimiento de la retroalimentación y, a veces, puede revelar características que la retroalimentación no pudo ajustar.
Las señales del AFM, como la altura de la muestra o la desviación del voladizo, se registran en una computadora durante el escaneo x-y. Se representan gráficamente en una imagen pseudocolor , en la que cada píxel representa una posición x-y en la muestra y el color representa la señal registrada.
El AFM fue inventado por científicos de IBM en 1985. [7] El precursor del AFM, el microscopio de efecto túnel de barrido (STM), fue desarrollado por Gerd Binnig y Heinrich Rohrer a principios de la década de 1980 en IBM Research – Zurich , un desarrollo que les valió el Premio Nobel de Física en 1986. Binnig inventó [6] el microscopio de fuerza atómica y la primera implementación experimental fue realizada por Binnig, Quate y Gerber en 1986. [8]
El primer microscopio de fuerza atómica disponible comercialmente se introdujo en 1989. El AFM es una de las principales herramientas para obtener imágenes, medir y manipular materia a escala nanométrica .
El AFM se ha aplicado a problemas en una amplia gama de disciplinas de las ciencias naturales, incluida la física del estado sólido , la ciencia y tecnología de semiconductores , la ingeniería molecular , la química y física de polímeros , la química de superficies , la biología molecular , la biología celular y la medicina .
Las aplicaciones en el campo de la física del estado sólido incluyen (a) la identificación de átomos en una superficie, (b) la evaluación de las interacciones entre un átomo específico y sus átomos vecinos, y (c) el estudio de los cambios en las propiedades físicas que surgen de los cambios en una disposición atómica a través de la manipulación atómica.
En biología molecular, la AFM se puede utilizar para estudiar la estructura y las propiedades mecánicas de los complejos y conjuntos proteicos. Por ejemplo, la AFM se ha utilizado para obtener imágenes de microtúbulos y medir su rigidez.
En biología celular, la AFM se puede utilizar para intentar distinguir las células cancerosas de las normales en función de la dureza de las células, y para evaluar las interacciones entre una célula específica y sus células vecinas en un sistema de cultivo competitivo. La AFM también se puede utilizar para marcar células, para estudiar cómo regulan la rigidez o la forma de la membrana o la pared celular.
En algunas variantes, también se pueden escanear los potenciales eléctricos utilizando voladizos conductores. En versiones más avanzadas, se pueden pasar corrientes a través de la punta para sondear la conductividad eléctrica o el transporte de la superficie subyacente, pero se trata de una tarea difícil de la que pocos grupos de investigación han informado datos consistentes (hasta 2004). [9]
El AFM consiste en un voladizo con una punta afilada (sonda) en su extremo que se utiliza para escanear la superficie de la muestra. El voladizo es típicamente de silicio o nitruro de silicio con un radio de curvatura de la punta del orden de nanómetros. Cuando la punta se acerca a la superficie de una muestra, las fuerzas entre la punta y la muestra conducen a una desviación del voladizo de acuerdo con la ley de Hooke . [10] Dependiendo de la situación, las fuerzas que se miden en AFM incluyen fuerza de contacto mecánico, fuerzas de van der Waals , fuerzas capilares , enlace químico , fuerzas electrostáticas , fuerzas magnéticas (ver microscopio de fuerza magnética , MFM), fuerzas de Casimir , fuerzas de solvatación , etc. Junto con la fuerza, se pueden medir simultáneamente cantidades adicionales mediante el uso de tipos especializados de sondas (ver microscopía térmica de barrido , microscopía de expansión Joule de barrido , microespectroscopia fototérmica , etc.).
El AFM puede funcionar en varios modos, según la aplicación. En general, los modos de obtención de imágenes posibles se dividen en modos estáticos (también llamados de contacto ) y una variedad de modos dinámicos (sin contacto o "golpeteo") en los que el voladizo vibra u oscila a una frecuencia determinada. [8]
El funcionamiento del AFM se describe generalmente como uno de tres modos, según la naturaleza del movimiento de la punta: modo de contacto, también llamado modo estático (a diferencia de los otros dos modos, que se denominan modos dinámicos); modo de golpeteo, también llamado contacto intermitente, modo CA o modo vibratorio, o, después del mecanismo de detección, modulación de amplitud AFM; y modo sin contacto, o, nuevamente después del mecanismo de detección, modulación de frecuencia AFM.
A pesar de la nomenclatura, el contacto repulsivo puede ocurrir o evitarse tanto en la modulación de amplitud AFM como en la modulación de frecuencia AFM, dependiendo de la configuración. [ cita requerida ]
En el modo de contacto, la punta se "arrastra" a lo largo de la superficie de la muestra y los contornos de la superficie se miden ya sea utilizando la desviación del voladizo directamente o, más comúnmente, utilizando la señal de retroalimentación requerida para mantener el voladizo en una posición constante. Debido a que la medición de una señal estática es propensa al ruido y la deriva, se utilizan voladizos de baja rigidez (es decir, voladizos con una constante de resorte baja, k) para lograr una señal de desviación lo suficientemente grande mientras se mantiene baja la fuerza de interacción. Cerca de la superficie de la muestra, las fuerzas de atracción pueden ser bastante fuertes, lo que hace que la punta se "encaje" en la superficie. Por lo tanto, el AFM en modo de contacto casi siempre se realiza a una profundidad donde la fuerza general es repulsiva, es decir, en "contacto" firme con la superficie sólida.
En condiciones ambientales, la mayoría de las muestras desarrollan una capa de menisco líquido. Debido a esto, mantener la punta de la sonda lo suficientemente cerca de la muestra para que las fuerzas de corto alcance se vuelvan detectables mientras se evita que la punta se adhiera a la superficie presenta un problema importante para el modo de contacto en condiciones ambientales. El modo de contacto dinámico (también llamado contacto intermitente, modo AC o modo de golpeteo) se desarrolló para evitar este problema. [12] Hoy en día, el modo de golpeteo es el modo AFM más utilizado cuando se opera en condiciones ambientales o en líquidos.
En el modo de golpeteo , el voladizo se impulsa para oscilar hacia arriba y hacia abajo en o cerca de su frecuencia de resonancia. Esta oscilación se logra comúnmente con un pequeño elemento piezoeléctrico en el soporte del voladizo, pero otras posibilidades incluyen un campo magnético de CA (con voladizos magnéticos), voladizos piezoeléctricos o calentamiento periódico con un haz láser modulado. La amplitud de esta oscilación generalmente varía de varios nm a 200 nm. En el modo de golpeteo, la frecuencia y la amplitud de la señal de accionamiento se mantienen constantes, lo que lleva a una amplitud constante de la oscilación del voladizo siempre que no haya deriva o interacción con la superficie. La interacción de fuerzas que actúan sobre el voladizo cuando la punta se acerca a la superficie, las fuerzas de van der Waals , las interacciones dipolo-dipolo , las fuerzas electrostáticas , etc. hacen que la amplitud de la oscilación del voladizo cambie (generalmente disminuya) a medida que la punta se acerca a la muestra. Esta amplitud se utiliza como parámetro que se introduce en el servomotor electrónico que controla la altura del voladizo por encima de la muestra. El servomotor ajusta la altura para mantener una amplitud de oscilación del voladizo establecida a medida que el voladizo se escanea sobre la muestra. Por lo tanto, se produce una imagen de AFM con golpeteo al captar la fuerza de los contactos intermitentes de la punta con la superficie de la muestra. [13]
Aunque las fuerzas máximas aplicadas durante la parte de contacto de la oscilación pueden ser mucho más altas que las que se usan normalmente en el modo de contacto, el modo de golpeteo generalmente reduce el daño causado a la superficie y la punta en comparación con la cantidad causada en el modo de contacto. Esto se puede explicar por la corta duración de la fuerza aplicada y porque las fuerzas laterales entre la punta y la muestra son significativamente menores en el modo de golpeteo que en el modo de contacto. La obtención de imágenes en modo de golpeteo es lo suficientemente suave incluso para la visualización de bicapas lipídicas soportadas o moléculas de polímero individuales adsorbidas (por ejemplo, cadenas de polielectrolitos sintéticos de 0,4 nm de espesor ) en un medio líquido. Con los parámetros de escaneo adecuados, la conformación de moléculas individuales puede permanecer sin cambios durante horas, [11] e incluso se pueden obtener imágenes de motores moleculares individuales mientras se mueven.
En el modo de golpeteo, también se puede registrar la fase de oscilación del voladizo con respecto a la señal de accionamiento. Este canal de señal contiene información sobre la energía disipada por el voladizo en cada ciclo de oscilación. Las muestras que contienen regiones de rigidez variable o con diferentes propiedades de adhesión pueden presentar un contraste en este canal que no es visible en la imagen topográfica. Sin embargo, extraer las propiedades del material de la muestra de forma cuantitativa a partir de imágenes de fase no es factible.
En el modo de microscopía de fuerza atómica sin contacto , la punta del voladizo no entra en contacto con la superficie de la muestra. En cambio, el voladizo oscila a su frecuencia de resonancia (modulación de frecuencia) o justo por encima (modulación de amplitud), donde la amplitud de oscilación suele ser de unos pocos nanómetros (<10 nm) hasta unos pocos picómetros. [14] Las fuerzas de van der Waals , que son más fuertes de 1 nm a 10 nm por encima de la superficie, o cualquier otra fuerza de largo alcance que se extienda por encima de la superficie, actúan para disminuir la frecuencia de resonancia del voladizo. Esta disminución de la frecuencia de resonancia combinada con el sistema de bucle de retroalimentación mantiene una amplitud o frecuencia de oscilación constante ajustando la distancia promedio de la punta a la muestra. Medir la distancia de la punta a la muestra en cada punto de datos (x, y) permite que el software de escaneo construya una imagen topográfica de la superficie de la muestra.
El modo sin contacto del AFM no sufre los efectos de degradación de la punta o de la muestra que a veces se observan después de tomar numerosas exploraciones con el AFM de contacto. Esto hace que el AFM sin contacto sea preferible al AFM de contacto para medir muestras blandas, por ejemplo, muestras biológicas y películas delgadas orgánicas. En el caso de muestras rígidas, las imágenes de contacto y sin contacto pueden parecer iguales. Sin embargo, si unas pocas monocapas de fluido adsorbido se encuentran sobre la superficie de una muestra rígida, las imágenes pueden verse bastante diferentes. Un AFM que funciona en modo de contacto penetrará la capa de líquido para obtener imágenes de la superficie subyacente, mientras que en modo sin contacto un AFM oscilará por encima de la capa de fluido adsorbido para obtener imágenes tanto del líquido como de la superficie.
Los esquemas para el funcionamiento en modo dinámico incluyen la modulación de frecuencia , en la que se utiliza un bucle de bloqueo de fase para rastrear la frecuencia de resonancia del voladizo, y la modulación de amplitud más común, con un bucle servo en su lugar para mantener la excitación del voladizo a una amplitud definida. En la modulación de frecuencia, los cambios en la frecuencia de oscilación proporcionan información sobre las interacciones entre la punta y la muestra. La frecuencia se puede medir con una sensibilidad muy alta y, por lo tanto, el modo de modulación de frecuencia permite el uso de voladizos muy rígidos. Los voladizos rígidos proporcionan estabilidad muy cerca de la superficie y, como resultado, esta técnica fue la primera técnica AFM en proporcionar una resolución atómica real en condiciones de ultra alto vacío . [15]
En la modulación de amplitud , los cambios en la amplitud o fase de oscilación proporcionan la señal de retroalimentación para la obtención de imágenes. En la modulación de amplitud, los cambios en la fase de oscilación se pueden utilizar para discriminar entre diferentes tipos de materiales en la superficie. La modulación de amplitud se puede utilizar en el régimen sin contacto o en el régimen de contacto intermitente. En el modo de contacto dinámico, el voladizo oscila de manera que se modula la distancia de separación entre la punta del voladizo y la superficie de la muestra.
La modulación de amplitud también se ha utilizado en el régimen sin contacto para obtener imágenes con resolución atómica mediante el uso de voladizos muy rígidos y pequeñas amplitudes en un entorno de ultra alto vacío.
La formación de imágenes es un método de trazado que produce una asignación de colores al cambiar la posición x-y de la punta mientras se escanea y registra la variable medida, es decir, la intensidad de la señal de control, en cada coordenada x-y. La asignación de colores muestra el valor medido correspondiente a cada coordenada. La imagen expresa la intensidad de un valor como un tono. Por lo general, la correspondencia entre la intensidad de un valor y un tono se muestra como una escala de colores en las notas explicativas que acompañan a la imagen.
El modo de funcionamiento de la formación de imágenes del AFM se clasifica generalmente en dos grupos desde el punto de vista de si utiliza un bucle de retroalimentación z (no mostrado) para mantener la distancia entre la punta y la muestra y mantener la intensidad de la señal exportada por el detector. El primero (que utiliza un bucle de retroalimentación z) se denomina " modo XX constante " ( XX es algo que se mantiene mediante un bucle de retroalimentación z).
El modo de formación de imágenes topográficas se basa en el " modo XX constante " mencionado anteriormente, el bucle de retroalimentación z controla la distancia relativa entre la sonda y la muestra mediante la salida de señales de control para mantener constantes la frecuencia, la vibración y la fase que generalmente corresponde al movimiento del voladizo (por ejemplo, se aplica voltaje al elemento piezoeléctrico Z y mueve la muestra hacia arriba y hacia abajo en la dirección Z.
Cuando la distancia entre la sonda y la muestra se lleva al rango en el que se puede detectar la fuerza atómica, mientras que un voladizo se excita en su frecuencia propia natural ( f 0 ), la frecuencia de resonancia f del voladizo puede cambiar de su frecuencia de resonancia original. En otras palabras, en el rango en el que se puede detectar la fuerza atómica, también se observará un cambio de frecuencia ( df = f – f 0 ). Cuando la distancia entre la sonda y la muestra está en la región sin contacto , el cambio de frecuencia aumenta en dirección negativa a medida que la distancia entre la sonda y la muestra se hace más pequeña.
Cuando la muestra tiene concavidad y convexidad, la distancia entre la punta y la muestra varía de acuerdo con la concavidad y la convexidad acompañada de un escaneo de la muestra a lo largo de la dirección x-y (sin regulación de altura en la dirección z). Como resultado, surge el cambio de frecuencia. La imagen en la que se representan gráficamente los valores de la frecuencia obtenidos mediante un escaneo de trama a lo largo de la dirección x-y de la superficie de la muestra frente a la coordinación x-y de cada punto de medición se denomina imagen de altura constante.
Por otra parte, el df puede mantenerse constante moviendo la sonda hacia arriba y hacia abajo (véase (3) de la FIG. 5) en la dirección z utilizando una retroalimentación negativa (utilizando un bucle de retroalimentación z) mientras se realiza el barrido de trama de la superficie de la muestra a lo largo de la dirección x–y. La imagen en la que se representan gráficamente las cantidades de la retroalimentación negativa (la distancia de movimiento de la sonda hacia arriba y hacia abajo en la dirección z) frente a la coordinación x–y de cada punto de medición es una imagen topográfica. En otras palabras, la imagen topográfica es un trazo de la punta de la sonda regulada de modo que el df sea constante y también puede considerarse un gráfico de una superficie de altura constante del df.
Por lo tanto, la imagen topográfica del AFM no es la morfología exacta de la superficie en sí, sino en realidad la imagen influenciada por el orden de enlace entre la sonda y la muestra; sin embargo, se considera que la imagen topográfica del AFM refleja la forma geográfica de la superficie más que la imagen topográfica de un microscopio de túnel de barrido.
Además de la obtención de imágenes, el AFM se puede utilizar para la espectroscopia de fuerza , la medición directa de las fuerzas de interacción punta-muestra en función del espacio entre la punta y la muestra. El resultado de esta medición se denomina curva fuerza-distancia. Para este método, la punta del AFM se extiende hacia la superficie y se retrae de ella mientras se controla la deflexión del voladizo en función del desplazamiento piezoeléctrico . Estas mediciones se han utilizado para medir contactos a nanoescala, enlaces atómicos , fuerzas de Van der Waals y fuerzas de Casimir , fuerzas de disolución en líquidos y fuerzas de estiramiento y ruptura de moléculas individuales. [16] El AFM también se ha utilizado para medir, en un entorno acuoso, la fuerza de dispersión debida al polímero adsorbido en el sustrato. [17] Ahora se pueden medir rutinariamente fuerzas del orden de unos pocos piconewtons con una resolución de distancia vertical mejor que 0,1 nanómetros. La espectroscopia de fuerza se puede realizar con modos estáticos o dinámicos. En los modos dinámicos, además de la deflexión estática, se monitoriza información sobre la vibración del voladizo. [18]
Los problemas con la técnica incluyen la falta de medición directa de la separación entre la punta y la muestra y la necesidad común de ménsulas de baja rigidez, que tienden a "apretar" la superficie. Estos problemas no son insuperables. Se ha desarrollado un AFM que mide directamente la separación entre la punta y la muestra. [19] El ajuste puede reducirse midiendo en líquidos o utilizando ménsulas más rígidas, pero en este último caso se necesita un sensor de deflexión más sensible. Aplicando una pequeña vibración a la punta, también se puede medir la rigidez (gradiente de fuerza) de la unión. [20]
La espectroscopia de fuerza se utiliza en biofísica para medir las propiedades mecánicas de material vivo (como tejido o células) [21] [22] [23] o detectar estructuras de diferente rigidez enterradas en la masa de la muestra utilizando la tomografía de rigidez. [24] Otra aplicación fue medir las fuerzas de interacción entre, por un lado, un material pegado en la punta del cantilever y, por otro lado, la superficie de partículas libres u ocupadas por el mismo material. A partir de la curva de distribución de la fuerza de adhesión, se ha derivado un valor medio de las fuerzas. Permitió hacer una cartografía de la superficie de las partículas, cubiertas o no por el material. [25] El AFM también se ha utilizado para desdoblar mecánicamente proteínas. [26] En tales experimentos, los análisis de las fuerzas de desdoblamiento medias con el modelo apropiado [27] conducen a la obtención de información sobre la tasa de desdoblamiento y los parámetros del perfil de energía libre de la proteína.
El AFM se puede utilizar para obtener imágenes de átomos y estructuras en una variedad de superficies. El átomo en el vértice de la punta "detecta" átomos individuales en la superficie subyacente cuando comienza la formación de enlaces químicos con cada átomo. Debido a que estas interacciones químicas alteran sutilmente la frecuencia de vibración de la punta, se pueden detectar y mapear. Este principio se utilizó para distinguir entre átomos de silicio, estaño y plomo en una superficie de aleación, comparando estas huellas atómicas con valores obtenidos a partir de simulaciones de la teoría funcional de la densidad (DFT). [28]
Las fuerzas de interacción deben medirse con precisión para cada tipo de átomo esperado en la muestra y luego compararse con las fuerzas proporcionadas por las simulaciones DFT. Se descubrió que la punta interactuaba más fuertemente con los átomos de silicio, e interactuaba un 24% y un 41% menos fuertemente con los átomos de estaño y plomo, respectivamente. Cada tipo diferente de átomo podría identificarse en la matriz como la punta utilizando esta información. [28]
Una sonda AFM tiene una punta afilada en el extremo de oscilación libre de un voladizo que sobresale de un soporte. [29] Las dimensiones del voladizo están en la escala de micrómetros. El radio de la punta suele estar en la escala de unos pocos nanómetros a unas pocas decenas de nanómetros. (Existen sondas especializadas con radios de extremo mucho más grandes, por ejemplo, sondas para indentación de materiales blandos). El soporte del voladizo, también llamado chip de soporte, a menudo de 1,6 mm por 3,4 mm de tamaño, permite al operador sujetar el conjunto de voladizo/sonda AFM con pinzas y colocarlo en los clips de soporte correspondientes en el cabezal de escaneo del microscopio de fuerza atómica.
Este dispositivo se denomina comúnmente "sonda AFM", pero también se le conoce como "punta AFM" y "voladizo" (empleando el nombre de una sola pieza como nombre de todo el dispositivo). Una sonda AFM es un tipo particular de sonda SPM.
Las sondas AFM se fabrican con tecnología MEMS . La mayoría de las sondas AFM que se utilizan están hechas de silicio (Si), pero también se utilizan vidrio de borosilicato y nitruro de silicio . Las sondas AFM se consideran consumibles, ya que a menudo se reemplazan cuando el ápice de la punta se desafila o se contamina o cuando se rompe el voladizo. Pueden costar desde un par de decenas de dólares hasta cientos de dólares por voladizo para las combinaciones de voladizo/sonda más especializadas.
Para utilizar el dispositivo, la punta se acerca mucho a la superficie del objeto que se está investigando y el voladizo se desvía debido a la interacción entre la punta y la superficie, que es lo que el AFM está diseñado para medir. Se puede crear un mapa espacial de la interacción midiendo la deflexión en muchos puntos de una superficie 2D.
Se pueden detectar varios tipos de interacción. Dependiendo de la interacción bajo investigación, la superficie de la punta de la sonda AFM necesita ser modificada con un recubrimiento. Entre los recubrimientos utilizados están el oro , para la unión covalente de moléculas biológicas y la detección de su interacción con una superficie, [30] el diamante para una mayor resistencia al desgaste [31] y los recubrimientos magnéticos para detectar las propiedades magnéticas de la superficie investigada. [32] Existe otra solución para lograr imágenes magnéticas de alta resolución: equipar la sonda con un microSQUID . Las puntas de AFM se fabrican utilizando micromaquinado de silicio y el posicionamiento preciso del bucle microSQUID se logra utilizando litografía de haz de electrones. [33] La fijación adicional de un punto cuántico al ápice de la punta de una sonda conductora permite obtener imágenes del potencial de superficie con alta resolución lateral, microscopía de puntos cuánticos de barrido . [34]
La superficie de los voladizos también se puede modificar. Estos recubrimientos se aplican principalmente para aumentar la reflectancia del voladizo y mejorar la señal de deflexión.
Las fuerzas entre la punta y la muestra dependen en gran medida de la geometría de la punta. En los últimos años se han realizado diversos estudios para expresar las fuerzas como una función de los parámetros de la punta.
Entre las diferentes fuerzas que actúan entre la punta y la muestra, las fuerzas del menisco del agua son de gran interés, tanto en ambientes aéreos como líquidos. También se deben tener en cuenta otras fuerzas como la fuerza de Coulomb , las fuerzas de van der Waals , las interacciones de doble capa, las fuerzas de solvatación , las fuerzas de hidratación y las fuerzas hidrofóbicas.
Las fuerzas del menisco del agua son muy interesantes para las mediciones de AFM en el aire. Debido a la humedad ambiental , se forma una fina capa de agua entre la punta y la muestra durante las mediciones en el aire. La fuerza capilar resultante da lugar a una fuerte fuerza de atracción que tira de la punta hacia la superficie. De hecho, la fuerza de adhesión medida entre la punta y la muestra en el aire ambiente de humedad finita suele estar dominada por fuerzas capilares. Como consecuencia, es difícil separar la punta de la superficie. En el caso de muestras blandas, incluidos muchos polímeros y, en particular, materiales biológicos, la fuerte fuerza capilar adhesiva da lugar a la degradación y destrucción de la muestra al obtener imágenes en modo de contacto. Históricamente, estos problemas fueron una motivación importante para el desarrollo de imágenes dinámicas en el aire (por ejemplo, "modo de golpeteo"). Durante las imágenes en modo de golpeteo en el aire, aún se forman puentes capilares. Sin embargo, en condiciones de obtención de imágenes adecuadas, los puentes capilares se forman y se rompen en cada ciclo de oscilación del voladizo normal a la superficie, como se puede inferir a partir de un análisis de la amplitud del voladizo y las curvas de fase frente a distancia. [35] Como consecuencia, las fuerzas de corte destructivas se reducen en gran medida y se pueden investigar muestras blandas.
Para cuantificar la fuerza capilar de equilibrio es necesario partir de la ecuación de Laplace para la presión:
donde γ L , es la energía superficial y r 0 y r 1 están definidos en la figura.
La presión se aplica sobre un área de
donde θ es el ángulo entre la superficie de la punta y la superficie del líquido, mientras que h es la diferencia de altura entre el líquido circundante y la parte superior del menisco.
La fuerza que une las dos superficies es
La misma fórmula también podría calcularse en función de la humedad relativa.
Gao [36] calculó fórmulas para diferentes geometrías de punta. A modo de ejemplo, la fuerza disminuye un 20 % para una punta cónica con respecto a una punta esférica.
Al calcular estas fuerzas, se debe diferenciar entre la situación húmedo sobre seco y la situación húmedo sobre húmedo.
Para una punta esférica, la fuerza es:
donde θ es el ángulo de contacto de la esfera seca y φ es el ángulo sumergido, como se muestra en la figura
Para una punta cónica, la fórmula se convierte en:
donde δ es el ángulo del semicono y r 0 y h son parámetros del perfil del menisco.
El método más común para las mediciones de deflexión en voladizo es el método de deflexión del haz. En este método, la luz láser de un diodo de estado sólido se refleja en la parte posterior del voladizo y es recogida por un detector sensible a la posición (PSD) que consta de dos fotodiodos muy espaciados , cuya señal de salida es recogida por un amplificador diferencial . El desplazamiento angular del voladizo hace que un fotodiodo recoja más luz que el otro fotodiodo, lo que produce una señal de salida (la diferencia entre las señales de los fotodiodos normalizada por su suma), que es proporcional a la deflexión del voladizo. La sensibilidad del método de deflexión del haz es muy alta, y se puede obtener de forma rutinaria un nivel de ruido del orden de 10 fm Hz − 1 ⁄ 2 en un sistema bien diseñado. Aunque a este método a veces se le llama método de "palanca óptica", la señal no se amplifica si se alarga la trayectoria del haz. Un recorrido más largo del haz aumenta el movimiento del punto reflejado en los fotodiodos, pero también ensancha el punto en la misma cantidad debido a la difracción , de modo que la misma cantidad de potencia óptica se mueve de un fotodiodo al otro. El "apalancamiento óptico" (señal de salida del detector dividida por la desviación del voladizo) es inversamente proporcional a la apertura numérica de la óptica de enfoque del haz, siempre que el punto láser enfocado sea lo suficientemente pequeño como para caer completamente sobre el voladizo. También es inversamente proporcional a la longitud del voladizo.
La relativa popularidad del método de deflexión del haz se puede explicar por su alta sensibilidad y operación simple, y por el hecho de que los voladizos no requieren contactos eléctricos u otros tratamientos especiales y, por lo tanto, se pueden fabricar de manera relativamente económica con puntas afiladas integradas.
Existen muchos otros métodos para medir la deflexión del haz.
Los escáneres AFM están hechos de material piezoeléctrico , que se expande y contrae proporcionalmente a un voltaje aplicado. Si se alargan o contraen depende de la polaridad del voltaje aplicado. Tradicionalmente, la punta o muestra se monta en un "trípode" de tres cristales piezoeléctricos, cada uno responsable de escanear en las direcciones x , y y z . [8] En 1986, el mismo año en que se inventó el AFM, se desarrolló un nuevo escáner piezoeléctrico , el escáner de tubo, para su uso en STM. [42] Más tarde, se incorporaron escáneres de tubo a los AFM. El escáner de tubo puede mover la muestra en las direcciones x , y y z utilizando un solo piezo de tubo con un solo contacto interior y cuatro contactos externos. Una ventaja del escáner de tubo en comparación con el diseño de trípode original es un mejor aislamiento vibracional, resultante de la frecuencia de resonancia más alta de la construcción de un solo elemento, en combinación con una etapa de aislamiento de baja frecuencia de resonancia. Una desventaja es que el movimiento x - y puede causar un movimiento z no deseado que resulte en distorsión. Otro diseño popular para los escáneres AFM es la etapa de flexión , que utiliza piezos separados para cada eje y los acopla a través de un mecanismo de flexión.
Los escáneres se caracterizan por su sensibilidad, que es la relación entre el movimiento piezoeléctrico y el voltaje piezoeléctrico, es decir, cuánto se extiende o se contrae el material piezoeléctrico por voltio aplicado. Debido a las diferencias en el material o el tamaño, la sensibilidad varía de un escáner a otro. La sensibilidad varía de forma no lineal con respecto al tamaño del escaneo. Los escáneres piezoeléctricos muestran más sensibilidad al final que al principio de un escaneo. Esto hace que los escaneos hacia adelante y hacia atrás se comporten de manera diferente y muestren histéresis entre las dos direcciones de escaneo. [43] Esto se puede corregir aplicando un voltaje no lineal a los electrodos piezoeléctricos para provocar un movimiento lineal del escáner y calibrando el escáner en consecuencia. [43] Una desventaja de este enfoque es que requiere una recalibración porque el voltaje no lineal preciso necesario para corregir el movimiento no lineal cambiará a medida que el piezoeléctrico envejece (ver a continuación). Este problema se puede evitar añadiendo un sensor lineal a la etapa de muestra o etapa piezoeléctrica para detectar el movimiento real del piezoeléctrico. El sensor puede detectar las desviaciones del movimiento ideal y aplicar correcciones a la señal de accionamiento piezoeléctrico para corregir el movimiento piezoeléctrico no lineal. Este diseño se conoce como AFM de "bucle cerrado". Los AFM piezoeléctricos sin sensor se conocen como AFM de "bucle abierto".
La sensibilidad de los materiales piezoeléctricos disminuye exponencialmente con el tiempo. Esto hace que la mayor parte del cambio de sensibilidad se produzca en las etapas iniciales de la vida útil del escáner. Los escáneres piezoeléctricos se hacen funcionar durante aproximadamente 48 horas antes de salir de fábrica, de modo que ya han superado el punto en el que pueden sufrir grandes cambios de sensibilidad. A medida que el escáner envejece, la sensibilidad cambiará menos con el tiempo y rara vez será necesario recalibrarlo, [44] [45] aunque varios manuales de fabricantes recomiendan calibrar los AFM de bucle abierto una vez al mes o dos veces al mes.
El AFM tiene varias ventajas sobre el microscopio electrónico de barrido (SEM). A diferencia del microscopio electrónico, que proporciona una proyección bidimensional o una imagen bidimensional de una muestra, el AFM proporciona un perfil de superficie tridimensional. Además, las muestras observadas por AFM no requieren ningún tratamiento especial (como recubrimientos de metal o carbono) que cambiarían o dañarían irreversiblemente la muestra, y no suelen sufrir artefactos de carga en la imagen final. Si bien un microscopio electrónico necesita un entorno de vacío costoso para su correcto funcionamiento, la mayoría de los modos AFM pueden funcionar perfectamente bien en aire ambiente o incluso en un entorno líquido. Esto hace posible estudiar macromoléculas biológicas e incluso organismos vivos. En principio, el AFM puede proporcionar una resolución más alta que el SEM. Se ha demostrado que proporciona una verdadera resolución atómica en ultra alto vacío (UHV) y, más recientemente, en entornos líquidos. El AFM de alta resolución es comparable en resolución a la microscopía de efecto túnel de barrido y la microscopía electrónica de transmisión . El AFM también se puede combinar con una variedad de técnicas de microscopía óptica y espectroscopia, como la microscopía fluorescente o la espectroscopia infrarroja, lo que da lugar a la microscopía óptica de barrido de campo cercano , la nano-FTIR y amplía aún más su aplicabilidad. Los instrumentos AFM-ópticos combinados se han aplicado principalmente en las ciencias biológicas, pero recientemente han atraído un fuerte interés en la investigación fotovoltaica [13] y de almacenamiento de energía, [46] ciencias de polímeros, [47] nanotecnología [48] [49] e incluso investigación médica. [50]
Una desventaja del AFM en comparación con el microscopio electrónico de barrido (SEM) es el tamaño de la imagen de un solo barrido. En una pasada, el SEM puede obtener imágenes de un área del orden de milímetros cuadrados con una profundidad de campo del orden de milímetros, mientras que el AFM solo puede obtener imágenes de un área de barrido máxima de aproximadamente 150 × 150 micrómetros y una altura máxima del orden de 10 a 20 micrómetros. Un método para mejorar el tamaño del área escaneada para el AFM es mediante el uso de sondas paralelas de una manera similar a la del almacenamiento de datos de milpiés .
La velocidad de escaneo de un AFM también es una limitación. Tradicionalmente, un AFM no puede escanear imágenes tan rápido como un SEM, requiriendo varios minutos para un escaneo típico, mientras que un SEM es capaz de escanear casi en tiempo real, aunque con una calidad relativamente baja. La velocidad relativamente lenta de escaneo durante la obtención de imágenes con AFM a menudo conduce a una deriva térmica en la imagen [51] [52] [53], lo que hace que el AFM sea menos adecuado para medir distancias precisas entre características topográficas en la imagen. Sin embargo, se sugirieron varios diseños de acción rápida [54] [55] para aumentar la productividad del escaneo del microscopio, incluido lo que se denomina videoAFM (se están obteniendo imágenes de calidad razonable con videoAFM a una velocidad de video: más rápida que el SEM promedio). Para eliminar las distorsiones de la imagen inducidas por la deriva térmica, se han introducido varios métodos. [51] [52] [53]
Las imágenes AFM también pueden verse afectadas por la no linealidad, la histéresis [43] y el deslizamiento del material piezoeléctrico y la diafonía entre los ejes x , y , z que pueden requerir una mejora y filtrado de software. Dicho filtrado podría "aplanar" las características topográficas reales. Sin embargo, los AFM más nuevos utilizan software de corrección en tiempo real (por ejemplo, escaneo orientado a características [44] [51] ) o escáneres de bucle cerrado, que prácticamente eliminan estos problemas. Algunos AFM también utilizan escáneres ortogonales separados (a diferencia de un solo tubo), que también sirven para eliminar parte de los problemas de diafonía.
Al igual que con cualquier otra técnica de obtención de imágenes, existe la posibilidad de que se produzcan artefactos en la imagen , que podrían ser inducidos por una punta inadecuada, un entorno operativo deficiente o incluso por la propia muestra, como se muestra a la derecha. Estos artefactos en la imagen son inevitables; sin embargo, su aparición y efecto en los resultados se pueden reducir mediante diversos métodos. Los artefactos resultantes de una punta demasiado gruesa pueden deberse, por ejemplo, a una manipulación inadecuada o a colisiones de facto con la muestra, ya sea por un escaneo demasiado rápido o por tener una superficie irrazonablemente rugosa, lo que provoca el desgaste real de la punta.
Debido a la naturaleza de las sondas AFM, normalmente no pueden medir paredes empinadas o salientes. Se pueden utilizar ménsulas y AFM especialmente fabricados para modular la sonda tanto lateralmente como hacia arriba y hacia abajo (como con los modos dinámicos de contacto y sin contacto) para medir paredes laterales, a costa de ménsulas más caras, una resolución lateral menor y artefactos adicionales.
Los últimos esfuerzos en la integración de la nanotecnología y la investigación biológica han tenido éxito y muestran mucha promesa para el futuro, incluso en campos como la nanobiomecánica . [56] Dado que las nanopartículas son un vehículo potencial de administración de fármacos, las respuestas biológicas de las células a estas nanopartículas se exploran continuamente para optimizar su eficacia y cómo se podría mejorar su diseño. [57] Pyrgiotakis et al. pudieron estudiar la interacción entre las nanopartículas diseñadas con CeO2 y Fe2O3 y las células uniendo las nanopartículas diseñadas a la punta del AFM. [58] Los estudios han aprovechado el AFM para obtener más información sobre el comportamiento de las células vivas en medios biológicos. La espectroscopia de fuerza atómica en tiempo real (o nanoscopia) y la espectroscopia de fuerza atómica dinámica se han utilizado para estudiar células vivas y proteínas de membrana y su comportamiento dinámico a alta resolución, en la nanoescala. La obtención de imágenes y de información sobre la topografía y las propiedades de las células también ha proporcionado información sobre los procesos y mecanismos químicos que ocurren a través de la interacción célula-célula y las interacciones con otras moléculas de señalización (p. ej. ligandos). Evans y Calderwood utilizaron la microscopía de fuerza de una sola célula para estudiar las fuerzas de adhesión celular , la cinética de los enlaces/fuerza de los enlaces dinámicos y su papel en los procesos químicos como la señalización celular. [59] Scheuring, Lévy y Rigaud revisaron estudios en los que se utilizó AFM para explorar la estructura cristalina de las proteínas de membrana de las bacterias fotosintéticas. [60] Alsteen et al. han utilizado la nanoscopía basada en AFM para realizar un análisis en tiempo real de la interacción entre micobacterias vivas y fármacos antimicobacterianos (específicamente isoniazida , etionamida , etambutol y estreptomicina ), [61] lo que sirve como ejemplo de un análisis más profundo de las interacciones patógeno-fármaco que se puede realizar a través de AFM.
![{\displaystyle A\simeq 2\pi R\simeq [r_{eff}(1+\cos \theta )+h]}](https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/bdaec618f9921eea6a1fd6236e73ab4a6760bf83)
