La espectroscopia de fuerza es un conjunto de técnicas para el estudio de las interacciones y las fuerzas de enlace entre moléculas individuales. [1] [2] Estos métodos se pueden utilizar para medir las propiedades mecánicas de moléculas de polímeros individuales o proteínas , o enlaces químicos individuales . El nombre " espectroscopia de fuerza ", aunque ampliamente utilizado en la comunidad científica, es un tanto engañoso, porque no existe una verdadera interacción materia-radiación. [3]
Las técnicas que se pueden utilizar para realizar espectroscopia de fuerza incluyen microscopía de fuerza atómica , [2] pinzas ópticas , [4] pinzas magnéticas , espectroscopia de fuerza acústica, [5] microagujas, [6] y biomembranas. [7]
La espectroscopia de fuerza mide el comportamiento de una molécula bajo una fuerza mecánica de estiramiento o torsión . De esta manera, en los últimos años se ha aprendido mucho sobre el acoplamiento mecanoquímico en las enzimas responsables de la contracción muscular , el transporte en la célula , la generación de energía (F1-ATPasa), la replicación y transcripción del ADN (polimerasas), el desenrollado y desenrollado del ADN (topoisomerasas y helicasas). [8]
Como técnica de molécula única , a diferencia de las espectroscopias de conjunto típicas , permite al investigador determinar las propiedades de la molécula particular en estudio. En particular, se pueden observar eventos poco frecuentes, como cambios conformacionales, que quedan enmascarados en un conjunto.
Existen muchas formas de manipular moléculas individuales con precisión. Entre ellas, destacan las pinzas ópticas o magnéticas, los voladizos del microscopio de fuerza atómica (AFM) y la espectroscopia de fuerza acústica. En todas estas técnicas, una biomolécula, como una proteína o ADN, o algún otro biopolímero, tiene un extremo unido a una superficie o una esfera de tamaño micrométrico y el otro a un sensor de fuerza. El sensor de fuerza suele ser una esfera de tamaño micrométrico o un voladizo, cuyo desplazamiento se puede medir para determinar la fuerza.
Las moléculas adsorbidas en una superficie son captadas por una punta microscópica (de nanómetros de ancho) que se encuentra en el extremo de un voladizo elástico. En una versión más sofisticada de este experimento (Microscopía de Fuerza Química), las puntas se funcionalizan covalentemente con las moléculas de interés. [9] Luego, un controlador piezoeléctrico levanta el voladizo. Si alguna fuerza actúa sobre el voladizo elástico (por ejemplo, porque alguna molécula se está estirando entre la superficie y la punta), esta se desviará hacia arriba (fuerza repulsiva) o hacia abajo (fuerza atractiva). Según la ley de Hooke , esta deflexión será proporcional a la fuerza que actúa sobre el voladizo. La deflexión se mide por la posición de un rayo láser reflejado por el voladizo. Este tipo de configuración puede medir fuerzas tan bajas como 10 pN (10 −11 N ), el límite de resolución fundamental está dado por el ruido térmico del voladizo .
La denominada curva de fuerza es el gráfico de la fuerza (o, más precisamente, de la deflexión del voladizo) en función de la posición piezoeléctrica en el eje Z. Un resorte de Hooke ideal , por ejemplo, mostraría una curva de fuerza diagonal recta. Normalmente, las curvas de fuerza observadas en los experimentos de espectroscopia de fuerza consisten en una región de contacto (diagonal) donde la sonda entra en contacto con la superficie de la muestra y una región sin contacto donde la sonda está fuera de la superficie de la muestra. Cuando la fuerza de restauración del voladizo supera la fuerza de adhesión de la punta a la muestra, la sonda salta fuera de contacto y la magnitud de este salto se utiliza a menudo como una medida de la fuerza de adhesión o la fuerza de ruptura. En general, la ruptura de un enlace de la punta a la superficie es un proceso estocástico; por lo tanto, la cuantificación confiable de la fuerza de adhesión requiere tomar múltiples curvas de fuerza individuales. El histograma de las fuerzas de adhesión obtenidas en estas múltiples mediciones proporciona la salida de datos principal para la medición de espectroscopia de fuerza.
En biofísica, la espectroscopia de fuerza de una sola molécula se puede utilizar para estudiar el panorama energético subyacente a la interacción entre dos biomoléculas, como las proteínas. Aquí, un socio de unión se puede unir a la punta de un voladizo a través de una molécula de enlace flexible (cadena de PEG), mientras que el otro se inmoviliza en una superficie de sustrato. En un enfoque típico, el voladizo se acerca y se retrae repetidamente de la muestra a una velocidad constante. En algunos casos, se producirá la unión entre los dos socios, que se hará visible en la curva de fuerza, ya que el uso de un enlace flexible da lugar a una forma de curva característica (ver modelo de cadena similar a un gusano ) distinta de la adhesión. Las fuerzas de ruptura recopiladas se pueden analizar luego como una función de la tasa de carga del enlace. El gráfico resultante de la fuerza de ruptura promedio en función de la tasa de carga se llama espectro de fuerza y forma el conjunto de datos básico para la espectroscopia de fuerza dinámica . [10] [11]
En el caso ideal de una única barrera de energía afilada para las interacciones punta-muestra, el espectro de fuerza dinámica mostrará un aumento lineal de la fuerza de ruptura en función de un logaritmo de la tasa de carga, como se describe en un modelo propuesto por Bell et al. [12] Aquí, la pendiente del espectro de fuerza de ruptura es igual a , donde es la distancia desde el mínimo de energía hasta el estado de transición . Hasta ahora, existen varios modelos teóricos que describen la relación entre la tasa de carga y la fuerza de ruptura, basados en diferentes supuestos y prediciendo formas de curva distintas. [11] [13]
Por ejemplo, Ma X., Gosai A. et al. utilizaron espectroscopia de fuerza dinámica junto con simulaciones de dinámica molecular para descubrir la fuerza de unión entre la trombina, una proteína de coagulación sanguínea, y su aptámero de ADN. [14]
Una técnica desarrollada recientemente, la espectroscopia de fuerza acústica (AFS), permite la manipulación de la fuerza de cientos de moléculas y células individuales en paralelo, lo que proporciona un alto rendimiento experimental. [5] En esta técnica, un elemento piezoeléctrico excita de forma resonante ondas acústicas planas sobre un chip microfluídico. Las ondas acústicas generadas son capaces de ejercer fuerzas sobre microesferas con una densidad diferente a la del medio circundante. Las biomoléculas, como el ADN, el ARN o las proteínas, se pueden unir individualmente entre las microesferas y una superficie y luego sondearlas mediante las fuerzas acústicas ejercidas por el sensor piezoeléctrico. Con los dispositivos AFS es posible aplicar fuerzas que van desde 0 hasta varios cientos de picoNewtons sobre cientos de microesferas y obtener curvas de extensión de fuerza o histogramas de fuerzas de ruptura de muchos eventos individuales en paralelo.
Esta técnica se utiliza principalmente para estudiar las proteínas que se unen al ADN. Por ejemplo, se utilizó AFS para examinar la transcripción bacteriana con presencia de agentes antibacterianos. [15] Las proteínas virales también se pueden estudiar mediante AFS; por ejemplo, esta técnica se utilizó para explorar la compactación del ADN junto con otros enfoques de moléculas individuales. [16]
Las células también pueden ser manipuladas directamente por fuerzas acústicas o utilizando microesferas como mangos. [17]
Otra técnica que ha ido ganando terreno en los experimentos con moléculas individuales es el uso de pinzas ópticas para aplicar fuerzas mecánicas sobre las moléculas. Un haz de láser muy enfocado tiene la capacidad de atrapar y retener partículas (de material dieléctrico) en un rango de tamaño que va desde los nanómetros hasta los micrómetros. La acción de captura de las pinzas ópticas resulta de la fuerza dipolar o de gradiente óptico sobre la esfera dieléctrica. La técnica de utilizar un haz de láser enfocado como trampa de átomos se aplicó por primera vez en 1984 en los laboratorios Bell. Hasta entonces, los experimentos se habían llevado a cabo utilizando láseres de dirección opuesta como medio para atrapar partículas. Experimentos posteriores, en el mismo proyecto en los laboratorios Bell y en otros desde entonces, mostraron una manipulación sin daños en las células utilizando un láser infrarrojo. De este modo, se preparó el terreno para los experimentos biológicos con captura óptica.
Cada técnica tiene sus propias ventajas y desventajas. Por ejemplo, los voladizos AFM pueden medir eventos en escala de angstroms, en milisegundos, y fuerzas mayores a 10 pN. Si bien las microfibras de vidrio no pueden lograr una resolución espacial y temporal tan fina, pueden medir fuerzas de piconewton. Las pinzas ópticas permiten la medición de fuerzas de piconewton y desplazamientos nanométricos, que es un rango ideal para muchos experimentos biológicos. Las pinzas magnéticas pueden medir fuerzas de femtonewton y, además, también se pueden utilizar para aplicar torsión. Los dispositivos AFS permiten el análisis estadístico de las propiedades mecánicas de los sistemas biológicos mediante la aplicación de fuerzas de piconewton a cientos de partículas individuales en paralelo, con un tiempo de respuesta de submilisegundos.
Las aplicaciones comunes de la espectroscopia de fuerza son las mediciones de elasticidad de polímeros , especialmente biopolímeros como ARN y ADN . [18] Otra aplicación biofísica de la espectroscopia de fuerza de polímeros es el desdoblamiento de proteínas . [19] Las proteínas modulares pueden adsorberse a una superficie de oro o (más raramente) mica y luego estirarse. El desdoblamiento secuencial de módulos se observa como un patrón de dientes de sierra muy característico del gráfico de fuerza vs. alargamiento; cada diente corresponde al desdoblamiento de un solo módulo de proteína (aparte del último que generalmente es el desprendimiento de la molécula de proteína de la punta). Se puede obtener mucha información sobre la elasticidad de las proteínas y el desdoblamiento de las proteínas mediante esta técnica. Muchas proteínas en la célula viva deben enfrentar estrés mecánico.
Además, la espectroscopia de fuerza se puede utilizar para investigar la actividad enzimática de las proteínas implicadas en la replicación , transcripción , organización y reparación del ADN . Esto se logra midiendo la posición de una perla unida a un complejo de ADN-proteína bloqueado en una atadura de ADN que tiene un extremo unido a una superficie, mientras se mantiene la fuerza constante. Esta técnica se ha utilizado, por ejemplo, para estudiar la inhibición de la elongación de la transcripción por Klebsidina y Acinetodina. [20]
La otra aplicación principal de la espectroscopia de fuerza es el estudio de la resistencia mecánica de los enlaces químicos. En este caso, generalmente la punta se funcionaliza con un ligando que se une a otra molécula unida a la superficie. La punta se empuja sobre la superficie, lo que permite el contacto entre las dos moléculas, y luego se retrae hasta que se rompe el enlace recién formado. Se mide la fuerza con la que se rompe el enlace. Dado que la rotura mecánica es un proceso cinético y estocástico , la fuerza de rotura no es un parámetro absoluto, sino que es una función tanto de la temperatura como de la velocidad de tracción. Las bajas temperaturas y las altas velocidades de tracción corresponden a fuerzas de rotura más altas. Mediante un análisis cuidadoso de la fuerza de rotura a varias velocidades de tracción, es posible trazar un mapa del paisaje energético del enlace químico bajo fuerza mecánica. [21] Esto está dando lugar a resultados interesantes en el estudio de la interacción anticuerpo - antígeno , proteína-proteína, proteína-célula viva y enlaces de captura . [22]
Recientemente, esta técnica se ha utilizado en biología celular para medir las fuerzas estocásticas agregativas creadas por las proteínas motoras que influyen en el movimiento de partículas dentro del citoplasma. De esta manera, la microscopía de espectro de fuerza puede utilizarse mejor para comprender los numerosos procesos celulares que requieren el movimiento de partículas dentro del citoplasma. [23]
