La microscopía de fuerza atómica ( AFM ) o microscopía de fuerza de barrido ( SFM ) es un tipo de microscopía de sonda de barrido (SPM) de muy alta resolución , con una resolución demostrada del orden de fracciones de nanómetro , más de 1000 veces mejor que la difracción óptica. límite .
La microscopía de fuerza atómica [1] (AFM) es un tipo de microscopía de sonda de barrido (SPM), con una resolución demostrada del orden de fracciones de nanómetro , más de 1000 veces mejor que el límite de difracción óptica . La información se recopila "sintiendo" o "tocando" la superficie con una sonda mecánica. Los elementos piezoeléctricos que facilitan movimientos pequeños pero exactos y precisos por comando (electrónico) permiten un escaneo preciso. A pesar del nombre, el Microscopio de Fuerza Atómica no utiliza la fuerza nuclear .
El AFM tiene tres capacidades principales: medición de fuerza, imágenes topográficas y manipulación.
En la medición de fuerzas, los AFM se pueden utilizar para medir las fuerzas entre la sonda y la muestra en función de su separación mutua. Esto se puede aplicar para realizar espectroscopia de fuerza , para medir las propiedades mecánicas de la muestra, como el módulo de Young de la muestra , una medida de rigidez.
Para obtener imágenes, la reacción de la sonda a las fuerzas que la muestra le impone se puede utilizar para formar una imagen de la forma tridimensional (topografía) de una superficie de muestra en alta resolución. Esto se logra escaneando ráster la posición de la muestra con respecto a la punta y registrando la altura de la sonda que corresponde a una interacción constante sonda-muestra (consulte § Imagen topográfica para obtener más información). La topografía de la superficie se muestra comúnmente como un gráfico pseudocolor .
Aunque la publicación inicial sobre microscopía de fuerza atómica de Binnig, Quate y Gerber en 1986 especulaba sobre la posibilidad de lograr una resolución atómica, fue necesario superar profundos desafíos experimentales antes de que se demostrara en 1993 la resolución atómica de defectos y bordes de paso en condiciones ambientales (líquidas). de Ohnesorge y Binnig. [2] La verdadera resolución atómica de la superficie de silicio 7x7 (las imágenes atómicas de esta superficie obtenidas por STM habían convencido a la comunidad científica de la espectacular resolución espacial de la microscopía de efecto túnel) tuvo que esperar un poco más antes de que Giessibl la mostrara. [3]
En la manipulación, las fuerzas entre la punta y la muestra también se pueden utilizar para cambiar las propiedades de la muestra de forma controlada. Ejemplos de esto incluyen manipulación atómica, litografía con sonda de barrido y estimulación local de células.
Simultáneamente con la adquisición de imágenes topográficas, se pueden medir localmente otras propiedades de la muestra y mostrarlas como una imagen, a menudo con una resolución igualmente alta. Ejemplos de tales propiedades son propiedades mecánicas como rigidez o fuerza de adhesión y propiedades eléctricas como conductividad o potencial superficial. [4] De hecho, la mayoría de las técnicas SPM son extensiones de AFM que utilizan esta modalidad. [5]
La principal diferencia entre la microscopía de fuerza atómica y las tecnologías competidoras, como la microscopía óptica y la microscopía electrónica , es que el AFM no utiliza lentes ni irradiación de haz. Por lo tanto, no sufre una limitación en la resolución espacial debido a la difracción y la aberración, y no es necesario preparar un espacio para guiar el haz (creando un vacío) y teñir la muestra.
Hay varios tipos de microscopía de barrido, incluida la microscopía de sonda de barrido (que incluye AFM, microscopía de efecto túnel (STM) y microscopio óptico de barrido de campo cercano (SNOM/NSOM), microscopía STED (STED) y microscopía electrónica de barrido y AFM electroquímica , EC. -AFM). Aunque SNOM y STED utilizan luz visible , infrarroja o incluso de terahercios para iluminar la muestra, su resolución no está limitada por el límite de difracción.
La figura 3 muestra un AFM, que normalmente consta de las siguientes características. [6] Los números entre paréntesis corresponden a las características numeradas en la Fig. 3. Las direcciones de las coordenadas están definidas por el sistema de coordenadas (0).
El pequeño voladizo (1) con forma de resorte es soportado por el soporte (2). Opcionalmente, un elemento piezoeléctrico (típicamente hecho de un material cerámico) (3) hace oscilar el voladizo (1). La punta afilada (4) se fija al extremo libre del voladizo (1). El detector (5) registra la desviación y el movimiento del voladizo (1). La muestra (6) se monta en la plataforma de muestra (8). Un accionamiento xyz (7) permite desplazar la muestra (6) y la etapa de muestra (8) en las direcciones x, y y z con respecto al vértice de la punta (4). Aunque la Fig. 3 muestra la unidad conectada a la muestra, la unidad también se puede conectar a la punta, o se pueden conectar unidades independientes a ambas, ya que lo que necesita controlarse es el desplazamiento relativo de la muestra y la punta. Los controladores y el trazador no se muestran en la Fig. 3.
Según la configuración descrita anteriormente, la interacción entre la punta y la muestra, que puede ser un fenómeno de escala atómica, se traduce en cambios del movimiento del voladizo, que es un fenómeno de macroescala. Se pueden utilizar varios aspectos diferentes del movimiento del voladizo para cuantificar la interacción entre la punta y la muestra, más comúnmente el valor de la deflexión, la amplitud de una oscilación impuesta del voladizo o el cambio en la frecuencia de resonancia del voladizo (consulte la sección Modos de imagen).
El detector (5) de AFM mide la deflexión (desplazamiento respecto a la posición de equilibrio) del voladizo y la convierte en una señal eléctrica. La intensidad de esta señal será proporcional al desplazamiento del voladizo.
Se pueden utilizar varios métodos de detección, por ejemplo, interferometría, palancas ópticas, el método piezoeléctrico y detectores basados en STM (consulte la sección "Medición de la deflexión del voladizo AFM").
Esta sección se aplica específicamente a las imágenes en § Modo de contacto. Para otros modos de imagen, el proceso es similar, excepto que la "desflexión" debe reemplazarse por la variable de retroalimentación adecuada.
Cuando se utiliza el AFM para obtener imágenes de una muestra, la punta se pone en contacto con la muestra y la muestra se escanea en forma de trama a lo largo de una cuadrícula x–y (figura 4). Lo más común es que se emplee un circuito de retroalimentación electrónica para mantener constante la fuerza de la sonda-muestra durante el escaneo. Este bucle de retroalimentación tiene la deflexión del voladizo como entrada y su salida controla la distancia a lo largo del eje z entre el soporte de la sonda (2 en la figura 3) y el soporte de la muestra (8 en la figura 3). Mientras la punta permanezca en contacto con la muestra y la muestra se explore en el plano x–y, las variaciones de altura en la muestra cambiarán la deflexión del voladizo. Luego, la retroalimentación ajusta la altura del soporte de la sonda para que la desviación se restablezca a un valor definido por el usuario (el punto de ajuste). Un circuito de retroalimentación correctamente ajustado ajusta la separación soporte-muestra continuamente durante el movimiento de escaneo, de modo que la desviación permanece aproximadamente constante. En esta situación, la salida de retroalimentación iguala la topografía de la superficie de la muestra con un pequeño error.
Históricamente, se ha utilizado un método de operación diferente, en el que la distancia de soporte entre la muestra y la sonda se mantiene constante y no está controlada por una retroalimentación ( servomecanismo ). En este modo, generalmente denominado "modo de altura constante", la deflexión del voladizo se registra como una función de la posición x–y de la muestra. Mientras la punta esté en contacto con la muestra, la desviación corresponde a la topografía de la superficie. Este método ahora se usa con menos frecuencia porque las fuerzas entre la punta y la muestra no están controladas, lo que puede generar fuerzas lo suficientemente altas como para dañar la punta o la muestra. [ cita necesaria ] Sin embargo, es una práctica común registrar la desviación incluso cuando se escanea en "modo de fuerza constante", con retroalimentación. Esto revela el pequeño error de seguimiento de la retroalimentación y, en ocasiones, puede revelar características que la retroalimentación no pudo ajustar.
Las señales del AFM, como la altura de la muestra o la desviación del voladizo, se registran en una computadora durante el escaneo x–y. Se trazan en una imagen pseudocolor , en la que cada píxel representa una posición x–y en la muestra y el color representa la señal grabada.
El AFM fue inventado por científicos de IBM en 1985. [7] El precursor del AFM, el microscopio de efecto túnel (STM), fue desarrollado por Gerd Binnig y Heinrich Rohrer a principios de la década de 1980 en IBM Research – Zurich , un desarrollo que les valió el Premio Nobel de Física de 1986 . Binnig inventó [6] el microscopio de fuerza atómica y la primera implementación experimental fue realizada por Binnig, Quate y Gerber en 1986. [8]
El primer microscopio de fuerza atómica disponible comercialmente se introdujo en 1989. El AFM es una de las principales herramientas para obtener imágenes, medir y manipular materia a nanoescala .
El AFM se ha aplicado a problemas en una amplia gama de disciplinas de las ciencias naturales, incluida la física del estado sólido , la ciencia y tecnología de semiconductores , la ingeniería molecular , la química y física de polímeros , la química de superficies , la biología molecular , la biología celular y la medicina .
Las aplicaciones en el campo de la física del estado sólido incluyen (a) la identificación de átomos en una superficie, (b) la evaluación de las interacciones entre un átomo específico y sus átomos vecinos, y (c) el estudio de cambios en las propiedades físicas que surgen de cambios en un arreglo atómico mediante manipulación atómica.
En biología molecular, el AFM se puede utilizar para estudiar la estructura y las propiedades mecánicas de complejos y conjuntos de proteínas. Por ejemplo, el AFM se ha utilizado para obtener imágenes de microtúbulos y medir su rigidez.
En biología celular, AFM se puede utilizar para intentar distinguir células cancerosas y células normales en función de la dureza de las células y para evaluar las interacciones entre una célula específica y sus células vecinas en un sistema de cultivo competitivo. AFM también se puede utilizar para sangrar células, para estudiar cómo regulan la rigidez o la forma de la membrana o pared celular.
En algunas variaciones, los potenciales eléctricos también se pueden escanear utilizando voladizos conductores . En versiones más avanzadas, se pueden pasar corrientes a través de la punta para sondear la conductividad eléctrica o el transporte de la superficie subyacente, pero esta es una tarea desafiante y pocos grupos de investigación reportan datos consistentes (a partir de 2004). [9]
El AFM consta de un voladizo con una punta afilada (sonda) en su extremo que se utiliza para escanear la superficie de la muestra. El voladizo suele ser silicio o nitruro de silicio con un radio de curvatura en la punta del orden de nanómetros. Cuando la punta se acerca a la superficie de una muestra, las fuerzas entre la punta y la muestra provocan una desviación del voladizo según la ley de Hooke . [10] Dependiendo de la situación, las fuerzas que se miden en AFM incluyen fuerza de contacto mecánica, fuerzas de van der Waals , fuerzas capilares , enlaces químicos , fuerzas electrostáticas , fuerzas magnéticas (ver microscopio de fuerza magnética , MFM), fuerzas de Casimir , fuerzas de solvatación , etc. Junto con la fuerza, se pueden medir simultáneamente cantidades adicionales mediante el uso de tipos especializados de sondas (ver microscopía térmica de barrido , microscopía de expansión en julios de barrido , microespectroscopia fototérmica , etc.).
El AFM puede funcionar en varios modos, según la aplicación. En general, los modos de imagen posibles se dividen en modos estáticos (también llamados de contacto ) y una variedad de modos dinámicos (sin contacto o "golpeteo") donde el voladizo vibra u oscila a una frecuencia determinada. [8]
El funcionamiento del AFM suele describirse como uno de tres modos, según la naturaleza del movimiento de la punta: modo de contacto, también llamado modo estático (a diferencia de los otros dos modos, que se denominan modos dinámicos); modo de golpeteo, también llamado contacto intermitente, modo AC o modo vibración, o, según el mecanismo de detección, modulación de amplitud AFM; y modo sin contacto, o, nuevamente después del mecanismo de detección, modulación de frecuencia AFM.
A pesar de la nomenclatura, el contacto repulsivo puede ocurrir o evitarse tanto en el AFM con modulación de amplitud como en el AFM con modulación de frecuencia, dependiendo de la configuración. [ cita necesaria ]
En el modo de contacto, la punta se "arrastra" a través de la superficie de la muestra y los contornos de la superficie se miden ya sea usando la deflexión del voladizo directamente o, más comúnmente, usando la señal de retroalimentación requerida para mantener el voladizo en una posición constante. . Debido a que la medición de una señal estática es propensa al ruido y la deriva, se utilizan voladizos de baja rigidez (es decir, voladizos con una constante de resorte baja, k) para lograr una señal de deflexión lo suficientemente grande mientras se mantiene baja la fuerza de interacción. Cerca de la superficie de la muestra, las fuerzas de atracción pueden ser bastante fuertes, provocando que la punta se "enganche" a la superficie. Por lo tanto, el AFM en modo de contacto casi siempre se realiza a una profundidad donde la fuerza general es repulsiva, es decir, en "contacto" firme con la superficie sólida.
En condiciones ambientales, la mayoría de las muestras desarrollan una capa de menisco líquido. Debido a esto, mantener la punta de la sonda lo suficientemente cerca de la muestra para que las fuerzas de corto alcance sean detectables y al mismo tiempo evitar que la punta se adhiera a la superficie presenta un problema importante para el modo de contacto en condiciones ambientales. El modo de contacto dinámico (también llamado contacto intermitente, modo AC o modo tapping) se desarrolló para evitar este problema. [12] Hoy en día, el modo de golpeteo es el modo AFM más utilizado cuando se opera en condiciones ambientales o en líquidos.
En el modo de golpeteo , el voladizo se hace oscilar hacia arriba y hacia abajo en o cerca de su frecuencia de resonancia. Esta oscilación se logra comúnmente con un pequeño elemento piezoeléctrico en el soporte del voladizo, pero otras posibilidades incluyen un campo magnético de CA (con voladizos magnéticos), voladizos piezoeléctricos o calentamiento periódico con un rayo láser modulado. La amplitud de esta oscilación suele variar entre varios nm y 200 nm. En el modo de golpeteo, la frecuencia y amplitud de la señal de conducción se mantienen constantes, lo que lleva a una amplitud constante de la oscilación del voladizo siempre que no haya deriva o interacción con la superficie. La interacción de fuerzas que actúan sobre el voladizo cuando la punta se acerca a la superficie, las fuerzas de van der Waals , las interacciones dipolo-dipolo , las fuerzas electrostáticas , etc., hacen que la amplitud de la oscilación del voladizo cambie (generalmente disminuya) a medida que la punta se acerca. a la muestra. Esta amplitud se utiliza como parámetro que ingresa al servo electrónico que controla la altura del voladizo sobre la muestra. El servo ajusta la altura para mantener una amplitud de oscilación del voladizo establecida a medida que el voladizo se escanea sobre la muestra. Por lo tanto, se produce una imagen AFM de golpeteo al obtener imágenes de la fuerza de los contactos intermitentes de la punta con la superficie de la muestra. [13]
Aunque las fuerzas máximas aplicadas durante la parte de contacto de la oscilación pueden ser mucho más altas que las que se usan normalmente en el modo de contacto, el modo de golpeteo generalmente disminuye el daño causado a la superficie y a la punta en comparación con la cantidad realizada en el modo de contacto. Esto puede explicarse por la corta duración de la fuerza aplicada y porque las fuerzas laterales entre la punta y la muestra son significativamente menores en el modo de golpeteo que en el modo de contacto. La obtención de imágenes en modo tapping es lo suficientemente suave incluso para la visualización de bicapas lipídicas soportadas o moléculas de polímeros individuales adsorbidas (por ejemplo, cadenas de polielectrolitos sintéticos de 0,4 nm de espesor ) en un medio líquido. Con los parámetros de escaneo adecuados, la conformación de moléculas individuales puede permanecer sin cambios durante horas, [11] e incluso se pueden obtener imágenes de motores de moléculas individuales mientras se mueven.
Cuando se opera en modo de golpeteo, también se puede registrar la fase de oscilación del voladizo con respecto a la señal de conducción. Este canal de señal contiene información sobre la energía disipada por el voladizo en cada ciclo de oscilación. Las muestras que contienen regiones de rigidez variable o con diferentes propiedades de adhesión pueden dar un contraste en este canal que no es visible en la imagen topográfica. Sin embargo, a menudo no es factible extraer las propiedades del material de la muestra de manera cuantitativa a partir de imágenes de fase.
En el modo de microscopía de fuerza atómica sin contacto , la punta del voladizo no entra en contacto con la superficie de la muestra. En cambio, el voladizo oscila a su frecuencia de resonancia (modulación de frecuencia) o justo por encima (modulación de amplitud), donde la amplitud de oscilación suele ser de unos pocos nanómetros (<10 nm) hasta unos pocos picómetros. [14] Las fuerzas de van der Waals , que son más fuertes entre 1 nm y 10 nm por encima de la superficie, o cualquier otra fuerza de largo alcance que se extienda por encima de la superficie, actúa para disminuir la frecuencia de resonancia del voladizo. Esta disminución de la frecuencia de resonancia combinada con el sistema de bucle de retroalimentación mantiene una amplitud o frecuencia de oscilación constante ajustando la distancia promedio entre la punta y la muestra. La medición de la distancia entre la punta y la muestra en cada punto de datos (x,y) permite que el software de escaneo construya una imagen topográfica de la superficie de la muestra.
El AFM en modo sin contacto no sufre los efectos de degradación de la punta o de la muestra que a veces se observan después de realizar numerosos escaneos con AFM de contacto. Esto hace que el AFM sin contacto sea preferible al AFM de contacto para medir muestras blandas, por ejemplo, muestras biológicas y películas finas orgánicas. En el caso de muestras rígidas, las imágenes de contacto y sin contacto pueden tener el mismo aspecto. Sin embargo, si unas pocas monocapas de fluido adsorbido se encuentran sobre la superficie de una muestra rígida, las imágenes pueden verse bastante diferentes. Un AFM que funcione en modo de contacto penetrará la capa de líquido para obtener imágenes de la superficie subyacente, mientras que en el modo sin contacto un AFM oscilará sobre la capa de líquido adsorbido para obtener imágenes tanto del líquido como de la superficie.
Los esquemas para la operación en modo dinámico incluyen modulación de frecuencia donde se usa un bucle de bloqueo de fase para rastrear la frecuencia de resonancia del voladizo y la modulación de amplitud más común con un servo bucle colocado para mantener la excitación del voladizo en una amplitud definida. En la modulación de frecuencia, los cambios en la frecuencia de oscilación proporcionan información sobre las interacciones punta-muestra. La frecuencia se puede medir con una sensibilidad muy alta y, por tanto, el modo de modulación de frecuencia permite el uso de voladizos muy rígidos. Los voladizos rígidos proporcionan estabilidad muy cerca de la superficie y, como resultado, esta técnica fue la primera técnica AFM que proporcionó una verdadera resolución atómica en condiciones de vacío ultra alto . [15]
En la modulación de amplitud , los cambios en la amplitud o fase de la oscilación proporcionan la señal de retroalimentación para la obtención de imágenes. En la modulación de amplitud, los cambios en la fase de oscilación se pueden utilizar para discriminar entre diferentes tipos de materiales en la superficie. La modulación de amplitud se puede operar en régimen sin contacto o en régimen de contacto intermitente. En el modo de contacto dinámico, el voladizo oscila de manera que se modula la distancia de separación entre la punta del voladizo y la superficie de la muestra.
La modulación de amplitud también se ha utilizado en el régimen sin contacto para obtener imágenes con resolución atómica mediante el uso de voladizos muy rígidos y pequeñas amplitudes en un entorno de vacío ultra alto.
La formación de imágenes es un método de trazado que produce un mapeo de color cambiando la posición x–y de la punta mientras se escanea y registra la variable medida, es decir, la intensidad de la señal de control, en cada coordenada x–y. El mapeo de colores muestra el valor medido correspondiente a cada coordenada. La imagen expresa la intensidad de un valor como un matiz. Habitualmente, la correspondencia entre la intensidad de un valor y un tono se muestra como una escala de colores en las notas explicativas que acompañan a la imagen.
El modo de operación de formación de imágenes del AFM generalmente se clasifica en dos grupos desde el punto de vista de si utiliza un bucle de retroalimentación z (no mostrado) para mantener la distancia punta-muestra para mantener la intensidad de la señal exportada por el detector. El primero (que usa el bucle z-Feedback), se dice que es el " modo XX constante " ( XX es algo que se mantiene mediante el bucle z-Feedback).
El modo de formación de imágenes topográficas se basa en el " modo XX constante " mencionado anteriormente; el bucle de retroalimentación z controla la distancia relativa entre la sonda y la muestra mediante la emisión de señales de control para mantener constante la frecuencia, vibración y fase que normalmente corresponde al movimiento del voladizo. (por ejemplo, se aplica voltaje al elemento piezoeléctrico Z y éste mueve la muestra hacia arriba y hacia abajo en dirección Z.
Cuando la distancia entre la sonda y la muestra se lleva al rango donde se puede detectar la fuerza atómica, mientras un voladizo se excita en su frecuencia propia natural ( f 0 ) , la frecuencia de resonancia f del voladizo puede cambiar de su frecuencia de resonancia original. En otras palabras, en el rango donde se puede detectar la fuerza atómica, también se observará un cambio de frecuencia ( df = f – f 0 ). Cuando la distancia entre la sonda y la muestra está en la región sin contacto , el cambio de frecuencia aumenta en dirección negativa a medida que la distancia entre la sonda y la muestra se hace más pequeña.
Cuando la muestra tiene concavidad y convexidad, la distancia entre el vértice de la punta y la muestra varía de acuerdo con la concavidad y la convexidad acompañadas de un escaneo de la muestra en la dirección x – y (sin regulación de altura en la dirección z). Como resultado, surge el cambio de frecuencia. La imagen en la que los valores de la frecuencia obtenidos mediante un escaneo ráster a lo largo de la dirección x – y de la superficie de la muestra se trazan contra la coordinación x – y de cada punto de medición se denomina imagen de altura constante.
Por otro lado, el df se puede mantener constante moviendo la sonda hacia arriba y hacia abajo (ver (3) de la FIG.5) en la dirección z usando una retroalimentación negativa (usando un bucle de retroalimentación z) mientras se realiza el escaneo rasterizado de la superficie de la muestra a lo largo de la dirección x-y. La imagen en la que las cantidades de retroalimentación negativa (la distancia de movimiento de la sonda hacia arriba y hacia abajo en la dirección z) se trazan contra la coordinación x-y de cada punto de medición es una imagen topográfica. En otras palabras, la imagen topográfica es un trazo de la punta de la sonda regulada para que el df sea constante y también puede considerarse como un trazado de una superficie de altura constante del df.
Por lo tanto, la imagen topográfica del AFM no es la morfología exacta de la superficie en sí, sino que en realidad es la imagen influenciada por el orden de enlace entre la sonda y la muestra; sin embargo, se considera que la imagen topográfica del AFM refleja la forma geográfica de la superficie más que la imagen topográfica de un microscopio de túnel de barrido.
Además de obtener imágenes, el AFM se puede utilizar para espectroscopia de fuerza , la medición directa de las fuerzas de interacción punta-muestra en función del espacio entre la punta y la muestra. El resultado de esta medición se llama curva fuerza-distancia. Para este método, la punta del AFM se extiende hacia la superficie y se retrae desde ella mientras se monitorea la deflexión del voladizo en función del desplazamiento piezoeléctrico . Estas mediciones se han utilizado para medir contactos a nanoescala, enlaces atómicos , fuerzas de Van der Waals y fuerzas de Casimir , fuerzas de disolución en líquidos y fuerzas de estiramiento y ruptura de una sola molécula. [16] El AFM también se ha utilizado para medir, en un ambiente acuoso, la fuerza de dispersión debida al polímero adsorbido en el sustrato. [17] Ahora se pueden medir de forma rutinaria fuerzas del orden de unos pocos piconewtons con una resolución de distancia vertical superior a 0,1 nanómetros. La espectroscopia de fuerza se puede realizar en modo estático o dinámico. En los modos dinámicos, además de la desviación estática, se monitoriza información sobre la vibración del voladizo. [18]
Los problemas con la técnica incluyen la falta de medición directa de la separación punta-muestra y la necesidad común de voladizos de baja rigidez, que tienden a "encajar" en la superficie. Estos problemas no son insuperables. Se ha desarrollado un AFM que mide directamente la separación punta-muestra. [19] El encaje se puede reducir midiendo en líquidos o utilizando voladizos más rígidos, pero en el último caso se necesita un sensor de deflexión más sensible. Aplicando un pequeño difuminado a la punta, también se puede medir la rigidez (gradiente de fuerza) de la unión. [20]
La espectroscopia de fuerza se utiliza en biofísica para medir las propiedades mecánicas del material vivo (como tejido o células) [21] [22] [23] o detectar estructuras de diferente rigidez enterradas en la mayor parte de la muestra mediante la tomografía de rigidez. [24] Otra aplicación fue medir las fuerzas de interacción entre, por un lado, un material pegado en la punta del voladizo y, por otro lado, la superficie de partículas libres u ocupadas por el mismo material. A partir de la curva de distribución de fuerzas de adherencia se deduce un valor medio de las fuerzas. Permitió realizar una cartografía de la superficie de las partículas, cubiertas o no por el material. [25] El AFM también se ha utilizado para el desarrollo mecánico de proteínas. [26] En tales experimentos, los análisis de las fuerzas medias de despliegue con el modelo apropiado [27] conducen a la obtención de información sobre la tasa de despliegue y los parámetros del perfil de energía libre de la proteína.
El AFM se puede utilizar para obtener imágenes y manipular átomos y estructuras en una variedad de superficies. El átomo en el vértice de la punta "detecta" átomos individuales en la superficie subyacente cuando forma enlaces químicos incipientes con cada átomo. Debido a que estas interacciones químicas alteran sutilmente la frecuencia de vibración de la punta, pueden detectarse y mapearse. Este principio se utilizó para distinguir entre átomos de silicio, estaño y plomo en una superficie de aleación, comparando estas "huellas dactilares atómicas" con valores obtenidos de simulaciones de la teoría funcional de la densidad (DFT). [28]
El truco consiste en medir primero estas fuerzas con precisión para cada tipo de átomo esperado en la muestra y luego compararlas con las fuerzas dadas por las simulaciones DFT. El equipo descubrió que la punta interactuaba más fuertemente con los átomos de silicio, e interactuaba un 24% y un 41% menos con los átomos de estaño y plomo, respectivamente. Por lo tanto, cada tipo diferente de átomo puede identificarse en la matriz a medida que la punta se mueve a través de la superficie.
Una sonda AFM tiene una punta afilada en el extremo libre de un voladizo que sobresale de un soporte. [29] Las dimensiones del voladizo están en la escala de micrómetros. El radio de la punta suele estar en la escala de unos pocos nanómetros a unas pocas decenas de nanómetros. (Existen sondas especializadas con radios finales mucho más grandes, por ejemplo, sondas para indentación de materiales blandos). El soporte en voladizo, también llamado chip de soporte, a menudo de 1,6 mm por 3,4 mm de tamaño, permite al operador sostener el conjunto de sonda/voladizo del AFM. con unas pinzas y colóquelo en los clips de soporte correspondientes en el cabezal de escaneo del microscopio de fuerza atómica.
Este dispositivo se denomina más comúnmente "sonda AFM", pero otros nombres incluyen "punta AFM" y " cantilever " (empleando el nombre de una sola pieza como nombre de todo el dispositivo). Una sonda AFM es un tipo particular de sonda SPM ( microscopía de sonda de barrido ).
Las sondas AFM están fabricadas con tecnología MEMS . La mayoría de las sondas AFM utilizadas están hechas de silicio (Si), pero también se utilizan vidrio de borosilicato y nitruro de silicio . Las sondas AFM se consideran consumibles ya que a menudo se reemplazan cuando el ápice de la punta se desafila o se contamina o cuando el voladizo se rompe. Pueden costar desde un par de decenas de dólares hasta cientos de dólares por voladizo para las combinaciones de voladizo/sonda más especializadas.
Solo la punta se acerca mucho a la superficie del objeto bajo investigación, el voladizo se desvía por la interacción entre la punta y la superficie, que es para lo que está diseñado el AFM. Se puede crear un mapa espacial de la interacción midiendo la deflexión en muchos puntos de una superficie 2D.
Se pueden detectar varios tipos de interacción. Dependiendo de la interacción que se esté investigando, es necesario modificar la superficie de la punta de la sonda AFM con un recubrimiento. Entre los recubrimientos utilizados se encuentran el oro , para la unión covalente de moléculas biológicas y la detección de su interacción con una superficie, [30] el diamante , para una mayor resistencia al desgaste [31] y los recubrimientos magnéticos para detectar las propiedades magnéticas de la superficie investigada. [32] Existe otra solución para lograr imágenes magnéticas de alta resolución: equipar la sonda con un microSQUID . Las puntas del AFM se fabrican mediante micromecanizado de silicio y el posicionamiento preciso del bucle microSQUID se realiza mediante litografía por haz de electrones. [33] La unión adicional de un punto cuántico al vértice de la punta de una sonda conductora permite obtener imágenes del potencial de la superficie con alta resolución lateral mediante microscopía de puntos cuánticos de barrido . [34]
También se puede modificar la superficie de los voladizos. Estos recubrimientos se aplican principalmente para aumentar la reflectancia del voladizo y mejorar la señal de deflexión.
Las fuerzas entre la punta y la muestra dependen en gran medida de la geometría de la punta. En los últimos años se han aprovechado varios estudios para escribir las fuerzas en función de los parámetros de la punta.
Entre las diferentes fuerzas entre la punta y la muestra, las fuerzas del menisco del agua son muy interesantes, tanto en ambiente aire como líquido. Se deben considerar otras fuerzas, como la fuerza de Coulomb , las fuerzas de van der Waals , las interacciones de doble capa, las fuerzas de solvatación , las fuerzas de hidratación y las fuerzas hidrofóbicas.
Las fuerzas de los meniscos del agua son muy interesantes para las mediciones de AFM en el aire. Debido a la humedad ambiental , se forma una fina capa de agua entre la punta y la muestra durante las mediciones en aire. La fuerza capilar resultante da lugar a una fuerte fuerza de atracción que atrae la punta hacia la superficie. De hecho, la fuerza de adhesión medida entre la punta y la muestra en aire ambiente con humedad finita suele estar dominada por fuerzas capilares. Como consecuencia, es difícil separar la punta de la superficie. Para muestras blandas que incluyen muchos polímeros y, en particular, materiales biológicos, la fuerte fuerza capilar adhesiva da lugar a la degradación y destrucción de la muestra al obtener imágenes en modo de contacto. Históricamente, estos problemas fueron una motivación importante para el desarrollo de imágenes dinámicas en el aire (por ejemplo, "modo tapping"). Durante la obtención de imágenes en modo tapping en el aire, todavía se forman puentes capilares. Sin embargo, para condiciones de imagen adecuadas, los puentes capilares se forman y rompen en cada ciclo de oscilación del voladizo normal a la superficie, como se puede inferir de un análisis de la amplitud del voladizo y las curvas de fase versus distancia. [35] Como consecuencia, las fuerzas de corte destructivas se reducen en gran medida y se pueden investigar muestras blandas.
Para cuantificar la fuerza capilar de equilibrio es necesario partir de la ecuación de Laplace para la presión:
donde γ L , es la energía superficial y r 0 y r 1 están definidos en la figura.
La presión se aplica sobre un área de
donde θ es el ángulo entre la superficie de la punta y la superficie del líquido, mientras que h es la diferencia de altura entre el líquido circundante y la parte superior del minisco.
La fuerza que une las dos superficies es
La misma fórmula también podría calcularse en función de la humedad relativa.
Gao [36] calculó fórmulas para diferentes geometrías de punta. A modo de ejemplo, la fuerza disminuye un 20% para una punta cónica con respecto a una punta esférica.
Cuando se calculan estas fuerzas, se debe hacer una diferencia entre la situación húmedo sobre seco y la situación húmedo sobre mojado.
Para una punta esférica, la fuerza es:
donde θ es el ángulo de contacto de la esfera seca y φ es el ángulo sumergido, como se muestra en la figura
Para una punta cónica, la fórmula queda:
donde δ es el ángulo del semicono y r 0 y h son parámetros del perfil del menisco.
El método más común para medir la deflexión del voladizo es el método de la deflexión del haz. En este método, la luz láser de un diodo de estado sólido se refleja en la parte posterior del voladizo y se recoge mediante un detector sensible a la posición (PSD) que consta de dos fotodiodos estrechamente espaciados , cuya señal de salida es recogida por un amplificador diferencial . El desplazamiento angular del voladizo da como resultado que un fotodiodo recoja más luz que el otro fotodiodo, produciendo una señal de salida (la diferencia entre las señales de los fotodiodos normalizadas por su suma), que es proporcional a la deflexión del voladizo. La sensibilidad del método de deflexión del haz es muy alta y en un sistema bien diseñado se puede obtener de forma rutinaria un ruido de fondo del orden de 10 fm Hz − 1 ⁄ 2 . Aunque este método a veces se denomina método de "palanca óptica", la señal no se amplifica si la trayectoria del haz se alarga. Una trayectoria del haz más larga aumenta el movimiento del punto reflejado en los fotodiodos, pero también ensancha el punto en la misma cantidad debido a la difracción , de modo que se mueve la misma cantidad de potencia óptica de un fotodiodo al otro. El "apalancamiento óptico" (señal de salida del detector dividida por la desviación del voladizo) es inversamente proporcional a la apertura numérica de la óptica de enfoque del haz, siempre que el punto láser enfocado sea lo suficientemente pequeño como para caer completamente sobre el voladizo. También es inversamente proporcional a la longitud del voladizo.
La relativa popularidad del método de desviación del haz puede explicarse por su alta sensibilidad y funcionamiento sencillo, y por el hecho de que los voladizos no requieren contactos eléctricos ni otros tratamientos especiales y, por tanto, pueden fabricarse de forma relativamente económica con puntas integradas afiladas.
Existen muchos otros métodos para medir la deflexión del haz.
Los escáneres AFM están hechos de material piezoeléctrico , que se expande y contrae proporcionalmente al voltaje aplicado. Si se alargan o contraen depende de la polaridad del voltaje aplicado. Tradicionalmente, la punta o muestra se monta en un "trípode" de tres cristales piezoeléctricos, cada uno de los cuales es responsable de escanear en las direcciones x , y y z . [8] En 1986, el mismo año en que se inventó el AFM, se desarrolló un nuevo escáner piezoeléctrico , el escáner de tubo, para su uso en STM. [42] Posteriormente se incorporaron escáneres de tubo a los AFM. El escáner de tubo puede mover la muestra en las direcciones x , y y z utilizando un piezoeléctrico de un solo tubo con un solo contacto interior y cuatro contactos externos. Una ventaja del escáner de tubo en comparación con el diseño de trípode original es un mejor aislamiento vibratorio, resultante de la mayor frecuencia de resonancia de la construcción de un solo elemento, en combinación con una etapa de aislamiento de baja frecuencia de resonancia. Una desventaja es que el movimiento x - y puede provocar un movimiento z no deseado que produzca distorsión. Otro diseño popular para los escáneres AFM es la etapa de flexión , que utiliza piezos separados para cada eje y los acopla a través de un mecanismo de flexión.
Los escáneres se caracterizan por su sensibilidad, que es la relación entre el movimiento piezoeléctrico y el voltaje piezoeléctrico, es decir, cuánto se extiende o contrae el material piezoeléctrico por voltio aplicado. Debido a las diferencias de material o tamaño, la sensibilidad varía de un escáner a otro. La sensibilidad varía de forma no lineal con respecto al tamaño del escaneo. Los escáneres piezoeléctricos exhiben más sensibilidad al final que al comienzo de un escaneo. Esto hace que los escaneos hacia adelante y hacia atrás se comporten de manera diferente y muestren histéresis entre las dos direcciones de escaneo. [43] Esto se puede corregir aplicando un voltaje no lineal a los electrodos piezoeléctricos para provocar un movimiento lineal del escáner y calibrando el escáner en consecuencia. [43] Una desventaja de este enfoque es que requiere recalibración porque el voltaje no lineal preciso necesario para corregir el movimiento no lineal cambiará a medida que el piezo envejezca (ver más abajo). Este problema se puede evitar agregando un sensor lineal a la etapa de muestra o etapa piezo para detectar el verdadero movimiento del piezo. El sensor puede detectar desviaciones del movimiento ideal y aplicar correcciones a la señal del accionamiento piezoeléctrico para corregir el movimiento piezoeléctrico no lineal. Este diseño se conoce como AFM de "bucle cerrado". Los AFM piezoeléctricos sin sensor se denominan AFM de "bucle abierto".
La sensibilidad de los materiales piezoeléctricos disminuye exponencialmente con el tiempo. Esto hace que la mayor parte del cambio en la sensibilidad ocurra en las etapas iniciales de la vida del escáner. Los escáneres piezoeléctricos se ejecutan durante aproximadamente 48 horas antes de salir de fábrica para que hayan superado el punto en el que pueden tener grandes cambios en la sensibilidad. A medida que el escáner envejece, la sensibilidad cambiará menos con el tiempo y el escáner rara vez requerirá recalibración, [44] [45] aunque varios manuales de fabricantes recomiendan una calibración mensual o quincenal de los AFM de circuito abierto.
AFM tiene varias ventajas sobre el microscopio electrónico de barrido (SEM). A diferencia del microscopio electrónico, que proporciona una proyección bidimensional o una imagen bidimensional de una muestra, el AFM proporciona un perfil de superficie tridimensional. Además, las muestras vistas por AFM no requieren ningún tratamiento especial (como recubrimientos de metal/carbono) que cambiarían o dañarían irreversiblemente la muestra y, por lo general, no sufren artefactos de carga en la imagen final. Si bien un microscopio electrónico necesita un entorno de vacío costoso para funcionar correctamente, la mayoría de los modos AFM pueden funcionar perfectamente en el aire ambiente o incluso en un entorno líquido. Esto permite estudiar macromoléculas biológicas e incluso organismos vivos. En principio, AFM puede proporcionar una resolución mayor que SEM. Se ha demostrado que proporciona una verdadera resolución atómica en vacío ultraalto (UHV) y, más recientemente, en entornos líquidos. El AFM de alta resolución es comparable en resolución a la microscopía de efecto túnel y a la microscopía electrónica de transmisión . AFM también se puede combinar con una variedad de técnicas de microscopía óptica y espectroscopia, como la microscopía fluorescente o la espectroscopia infrarroja, dando lugar a la microscopía óptica de barrido de campo cercano , nano-FTIR y ampliando aún más su aplicabilidad. Los instrumentos ópticos-AFM combinados se han aplicado principalmente en las ciencias biológicas, pero recientemente han atraído un gran interés en la energía fotovoltaica [13] y la investigación sobre el almacenamiento de energía, [46] las ciencias de los polímeros, [47] la nanotecnología [48] [49] e incluso la investigación médica. . [50]
Una desventaja del AFM en comparación con el microscopio electrónico de barrido (SEM) es el tamaño de la imagen de barrido único. En una sola pasada, el SEM puede obtener imágenes de un área del orden de milímetros cuadrados con una profundidad de campo del orden de milímetros, mientras que el AFM sólo puede obtener imágenes de un área de escaneo máxima de aproximadamente 150 × 150 micrómetros y una altura máxima del orden de 10 a 20 micrómetros. Un método para mejorar el tamaño del área escaneada para AFM es mediante el uso de sondas paralelas de una manera similar a la del almacenamiento de datos de los milpiés .
La velocidad de escaneo de un AFM también es una limitación. Tradicionalmente, un AFM no puede escanear imágenes tan rápido como un SEM, lo que requiere varios minutos para un escaneo típico, mientras que un SEM es capaz de escanear casi en tiempo real, aunque con una calidad relativamente baja. La velocidad relativamente lenta de escaneo durante la obtención de imágenes AFM a menudo conduce a una deriva térmica en la imagen [51] [52] [53], lo que hace que el AFM sea menos adecuado para medir distancias precisas entre características topográficas en la imagen. Sin embargo, se sugirieron varios diseños de acción rápida [54] [55] para aumentar la productividad del escaneo del microscopio, incluido lo que se denomina videoAFM (se obtienen imágenes de calidad razonable con videoAFM a una velocidad de video: más rápida que el SEM promedio). Para eliminar las distorsiones de la imagen inducidas por la deriva térmica, se han introducido varios métodos. [51] [52] [53]
Las imágenes AFM también pueden verse afectadas por la no linealidad, la histéresis [43] y la fluencia del material piezoeléctrico y la interferencia entre los ejes x , y , z que pueden requerir mejoras y filtrado del software . Este filtrado podría "aplanar" características topográficas reales. Sin embargo, los AFM más nuevos utilizan software de corrección en tiempo real (por ejemplo, escaneo orientado a funciones [44] [51] ) o escáneres de circuito cerrado, que prácticamente eliminan estos problemas. Algunos AFM también utilizan escáneres ortogonales separados (a diferencia de un solo tubo), que también sirven para eliminar parte de los problemas de diafonía.
Como ocurre con cualquier otra técnica de obtención de imágenes, existe la posibilidad de que se produzcan artefactos en la imagen , que podrían ser inducidos por una punta inadecuada, un entorno operativo deficiente o incluso por la propia muestra, como se muestra a la derecha. Estos artefactos de imagen son inevitables; sin embargo, su aparición y efecto sobre los resultados se pueden reducir mediante varios métodos. Los artefactos resultantes de una punta demasiado gruesa pueden deberse, por ejemplo, a una manipulación inadecuada o a colisiones de facto con la muestra, ya sea por escanear demasiado rápido o por tener una superficie excesivamente rugosa, lo que provoca un desgaste real de la punta.
Debido a la naturaleza de las sondas AFM, normalmente no pueden medir paredes empinadas o voladizos. Se pueden usar voladizos y AFM especialmente fabricados para modular la sonda hacia los lados, así como hacia arriba y hacia abajo (como con los modos de contacto dinámico y sin contacto) para medir las paredes laterales, a costa de voladizos más costosos, menor resolución lateral y artefactos adicionales.
Los últimos esfuerzos por integrar la nanotecnología y la investigación biológica han tenido éxito y son muy prometedores para el futuro, incluso en campos como la nanobiomecánica . [56] Dado que las nanopartículas son un vehículo potencial para la administración de fármacos, las respuestas biológicas de las células a estas nanopartículas se exploran continuamente para optimizar su eficacia y cómo se podría mejorar su diseño. [57] Pyrgiotakis et al. Pudieron estudiar la interacción entre las nanopartículas y células diseñadas con CeO 2 y Fe 2 O 3 uniendo las nanopartículas diseñadas a la punta del AFM. [58] Los estudios han aprovechado el AFM para obtener más información sobre el comportamiento de las células vivas en medios biológicos. La espectroscopia de fuerza atómica (o nanoscopia) en tiempo real y la espectroscopia de fuerza atómica dinámica se han utilizado para estudiar células vivas y proteínas de membrana y su comportamiento dinámico en alta resolución, en la nanoescala. La obtención de imágenes y la obtención de información sobre la topografía y las propiedades de las células también ha permitido comprender los procesos y mecanismos químicos que se producen a través de la interacción célula-célula y con otras moléculas de señalización (por ejemplo, ligandos). Evans y Calderwood utilizaron microscopía de fuerza unicelular para estudiar las fuerzas de adhesión celular , la cinética de enlace/fuerza de enlace dinámico y su papel en procesos químicos como la señalización celular. [59] Scheuring, Lévy y Rigaud revisaron estudios en los que AFM exploró la estructura cristalina de las proteínas de membrana de las bacterias fotosintéticas. [60] Alsteen y cols. han utilizado nanoscopía basada en AFM para realizar un análisis en tiempo real de la interacción entre micobacterias vivas y fármacos antimicobacterianos (específicamente isoniazida , etionamida , etambutol y estreptomicina ), [61] que sirve como ejemplo de un análisis más profundo de interacciones patógeno-fármaco que se pueden realizar a través de AFM.
![{\displaystyle A\simeq 2\pi R\simeq [r_{eff}(1+\cos \theta )+h]}](https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/bdaec618f9921eea6a1fd6236e73ab4a6760bf83)
