El microscopio óptico , también conocido como microscopio óptico , es un tipo de microscopio que comúnmente utiliza luz visible y un sistema de lentes para generar imágenes ampliadas de objetos pequeños. Los microscopios ópticos son el diseño de microscopio más antiguo y posiblemente se inventaron en su forma compuesta actual en el siglo XVII. Los microscopios ópticos básicos pueden ser muy simples, aunque muchos diseños complejos tienen como objetivo mejorar la resolución y el contraste de las muestras .
El objeto se coloca en un escenario y se puede observar directamente a través de uno o dos oculares del microscopio. En los microscopios de alta potencia, ambos oculares suelen mostrar la misma imagen, pero en un microscopio estereoscópico se utilizan imágenes ligeramente diferentes para crear un efecto tridimensional. Normalmente se utiliza una cámara para capturar la imagen ( micrografía ).
La muestra se puede iluminar de diversas formas. Los objetos transparentes se pueden iluminar desde abajo y los objetos sólidos se pueden iluminar con luz que atraviesa ( campo brillante ) o alrededor ( campo oscuro ) la lente del objetivo. Se puede utilizar luz polarizada para determinar la orientación del cristal de objetos metálicos. Las imágenes de contraste de fase se pueden utilizar para aumentar el contraste de la imagen resaltando pequeños detalles con diferentes índices de refracción.
Por lo general, se proporciona una variedad de lentes objetivos con diferentes aumentos montados en una torreta, lo que permite girarlos en su lugar y brindar la capacidad de hacer zoom. El poder de aumento máximo de los microscopios ópticos suele estar limitado a alrededor de 1000x debido al poder de resolución limitado de la luz visible. Si bien son posibles aumentos mayores, no se resuelven detalles adicionales del objeto.
Las alternativas a la microscopía óptica que no utilizan luz visible incluyen la microscopía electrónica de barrido , la microscopía electrónica de transmisión y la microscopía de sonda de barrido y, como resultado, pueden lograr aumentos mucho mayores.
Hay dos tipos básicos de microscopios ópticos: microscopios simples y microscopios compuestos. Un microscopio simple utiliza la potencia óptica de una sola lente o de un grupo de lentes para aumentar. Un microscopio compuesto utiliza un sistema de lentes (un conjunto amplía la imagen producida por otro) para lograr un aumento mucho mayor de un objeto. La gran mayoría de los microscopios de investigación modernos son microscopios compuestos, mientras que algunos microscopios digitales comerciales más baratos son microscopios simples de una sola lente. Los microscopios compuestos se pueden dividir en una variedad de otros tipos de microscopios, que difieren en sus configuraciones ópticas, costo y propósitos previstos.
Un microscopio simple utiliza una lente o un conjunto de lentes para ampliar un objeto mediante un aumento angular únicamente, brindando al espectador una imagen virtual ampliada y erecta . [1] [2] El uso de una sola lente convexa o grupos de lentes se encuentran en dispositivos de aumento simples como la lupa , lupas y oculares para telescopios y microscopios.
Un microscopio compuesto utiliza una lente cerca del objeto que se está observando para recolectar luz (llamada lente objetivo ), que enfoca una imagen real del objeto dentro del microscopio (imagen 1). Luego, esa imagen se magnifica mediante una segunda lente o grupo de lentes (llamada ocular ) que le brinda al espectador una imagen virtual invertida ampliada del objeto (imagen 2). [3] El uso de una combinación de objetivo/ocular compuesto permite un aumento mucho mayor. Los microscopios compuestos comunes suelen incluir lentes de objetivo intercambiables, lo que permite al usuario ajustar rápidamente el aumento. [3] Un microscopio compuesto también permite configuraciones de iluminación más avanzadas, como el contraste de fases .
Existen muchas variantes del diseño de microscopio óptico compuesto para fines especializados. Algunas de estas son diferencias de diseño físico que permiten la especialización para ciertos propósitos:
Otras variantes de microscopios están diseñadas para diferentes técnicas de iluminación:
Un microscopio digital es un microscopio equipado con una cámara digital que permite la observación de una muestra a través de una computadora . Los microscopios también pueden controlarse total o parcialmente por ordenador con distintos niveles de automatización. La microscopía digital permite un mayor análisis de una imagen microscópica, por ejemplo, mediciones de distancias y áreas y cuantificación de una tinción fluorescente o histológica .
También se encuentran disponibles comercialmente microscopios digitales de baja potencia, microscopios USB . Se trata esencialmente de cámaras web con una lente macro de alta potencia y, por lo general, no utilizan transiluminación . La cámara se conecta directamente al puerto USB de una computadora para mostrar las imágenes directamente en el monitor. Ofrecen aumentos modestos (hasta unos 200×) sin necesidad de utilizar oculares y a un coste muy bajo. La iluminación de alta potencia generalmente la proporciona una fuente o fuentes LED adyacentes a la lente de la cámara.
La microscopía digital con niveles de luz muy bajos para evitar daños a muestras biológicas vulnerables está disponible utilizando cámaras digitales sensibles con recuento de fotones . Se ha demostrado que una fuente de luz que proporcione pares de fotones entrelazados puede minimizar el riesgo de daño a las muestras más sensibles a la luz. En esta aplicación de imágenes fantasma a la microscopía de fotones dispersos, la muestra se ilumina con fotones infrarrojos, cada uno correlacionado espacialmente con un compañero entrelazado en la banda visible para obtener imágenes eficientes mediante una cámara de conteo de fotones. [7]
Los primeros microscopios eran lupas de una sola lente con aumento limitado, que se remontan al menos al uso generalizado de lentes en anteojos en el siglo XIII. [8]
Los microscopios compuestos aparecieron por primera vez en Europa alrededor de 1620 [9] [10] , incluido uno demostrado por Cornelis Drebbel en Londres (alrededor de 1621) y otro exhibido en Roma en 1624. [11] [12]
Se desconoce el inventor real del microscopio compuesto, aunque a lo largo de los años se han hecho muchas afirmaciones. Entre ellos se incluye una afirmación, 35 [13] años después de su aparición, del fabricante de gafas holandés Johannes Zachariassen de que su padre, Zacharias Janssen , inventó el microscopio compuesto y/o el telescopio ya en 1590. El testimonio de Johannes, que algunos afirman que es dudoso, [14] [15] [16] retrasa la fecha de la invención tan atrás que Zacharias habría sido un niño en ese momento, lo que llevó a la especulación de que, para que la afirmación de Johannes fuera cierta, el microscopio compuesto tendría que haber sido inventado por El abuelo de Johannes, Hans Martens. [17] Otra afirmación es que el competidor de Janssen, Hans Lippershey (quien solicitó la primera patente de telescopio en 1608) también inventó el microscopio compuesto. [18] Otros historiadores señalan al innovador holandés Cornelis Drebbel con su microscopio compuesto de 1621. [11] [12]
A veces se cita a Galileo Galilei como inventor del microscopio compuesto. Después de 1610, descubrió que podía enfocar de cerca su telescopio para ver objetos pequeños, como moscas, de cerca [19] y/o podía mirar por el extremo equivocado al revés para ampliar objetos pequeños. [20] El único inconveniente fue que su telescopio de 2 pies de largo tuvo que extenderse a 6 pies para ver objetos tan cercanos. [21] Después de ver el microscopio compuesto construido por Drebbel expuesto en Roma en 1624, Galileo construyó su propia versión mejorada. [11] [12] En 1625, Giovanni Faber acuñó el nombre de microscopio para el microscopio compuesto que Galileo presentó a la Accademia dei Lincei en 1624 [22] (Galileo lo había llamado " occhiolino " u " pequeño ojo "). Faber acuñó el nombre a partir de las palabras griegas μικρόν (micrón) que significa "pequeño" y σκοπεῖν (skopein) que significa "mirar", un nombre que pretende ser análogo a "telescopio", otra palabra acuñada por los linceanos. [23]
Christiaan Huygens , otro holandés, desarrolló un sistema ocular sencillo de dos lentes a finales del siglo XVII con corrección acromática , lo que supuso un gran paso adelante en el desarrollo de los microscopios. El ocular Huygens todavía se produce hasta el día de hoy, pero adolece de un tamaño de campo pequeño y otras desventajas menores.
A Antonie van Leeuwenhoek (1632-1724) se le atribuye haber llamado la atención de los biólogos sobre el microscopio, a pesar de que en el siglo XVI ya se producían lentes de aumento simples. Los microscopios caseros de Van Leeuwenhoek eran microscopios simples, con una única lente muy pequeña pero resistente. Eran incómodos de usar, pero permitieron a van Leeuwenhoek ver imágenes detalladas. Fueron necesarios unos 150 años de desarrollo óptico antes de que el microscopio compuesto pudiera proporcionar la misma calidad de imagen que los microscopios simples de van Leeuwenhoek, debido a las dificultades para configurar múltiples lentes. En la década de 1850, John Leonard Riddell , profesor de química en la Universidad de Tulane , inventó el primer microscopio binocular práctico mientras llevaba a cabo una de las primeras y más extensas investigaciones microscópicas estadounidenses sobre el cólera . [25] [26]
Si bien la tecnología y la óptica del microscopio básico han estado disponibles durante más de 400 años, es mucho más recientemente que se desarrollaron técnicas de iluminación de muestras para generar las imágenes de alta calidad que se ven hoy en día.
En agosto de 1893, August Köhler desarrolló la iluminación Köhler . Este método de iluminación de muestras da lugar a una iluminación extremadamente uniforme y supera muchas limitaciones de las técnicas más antiguas de iluminación de muestras. Antes del desarrollo de la iluminación Köhler, la imagen de la fuente de luz, por ejemplo el filamento de una bombilla , siempre era visible en la imagen de la muestra.
El Premio Nobel de Física fue otorgado al físico holandés Frits Zernike en 1953 por su desarrollo de la iluminación de contraste de fase que permite obtener imágenes de muestras transparentes. Al utilizar interferencia en lugar de absorción de luz, se pueden obtener imágenes de muestras extremadamente transparentes, como células vivas de mamíferos , sin tener que utilizar técnicas de tinción. Sólo dos años después, en 1955, Georges Nomarski publicó la teoría de la microscopía de contraste de interferencia diferencial , otra técnica de obtención de imágenes basada en interferencias .
La microscopía biológica moderna depende en gran medida del desarrollo de sondas fluorescentes para estructuras específicas dentro de una célula. A diferencia de la microscopía de luz transiluminada normal, en la microscopía de fluorescencia la muestra se ilumina a través de la lente del objetivo con un conjunto estrecho de longitudes de onda de luz. Esta luz interactúa con los fluoróforos de la muestra, que luego emiten luz de una longitud de onda más larga . Es esta luz emitida la que constituye la imagen.
Desde mediados del siglo XX , se han utilizado tinciones químicas fluorescentes, como DAPI , que se une al ADN , para marcar estructuras específicas dentro de la célula. Los desarrollos más recientes incluyen la inmunofluorescencia , que utiliza anticuerpos marcados con fluorescencia para reconocer proteínas específicas dentro de una muestra, y proteínas fluorescentes como GFP , que una célula viva puede expresar haciéndola fluorescente.
Todos los microscopios ópticos modernos diseñados para observar muestras mediante luz transmitida comparten los mismos componentes básicos del camino de la luz. Además, la gran mayoría de microscopios tienen los mismos componentes 'estructurales' [27] (numerados a continuación según la imagen de la derecha):
El ocular , o lente ocular, es un cilindro que contiene dos o más lentes; su función es enfocar la imagen para el ojo. El ocular se inserta en el extremo superior del tubo del cuerpo. Los oculares son intercambiables y se pueden insertar muchos oculares diferentes con diferentes grados de aumento. Los valores de aumento típicos para los oculares incluyen 5×, 10× (el más común), 15× y 20×. En algunos microscopios de alto rendimiento, la configuración óptica de la lente del objetivo y el ocular coinciden para brindar el mejor rendimiento óptico posible. Esto ocurre más comúnmente con objetivos apocromáticos .
Torreta de objetivo, revólver o boquilla giratoria es la pieza que sujeta el conjunto de lentes objetivo. Permite al usuario cambiar entre lentes objetivo.
En el extremo inferior de un microscopio óptico compuesto típico, hay una o más lentes objetivas que recogen la luz de la muestra. El objetivo suele estar en una carcasa cilíndrica que contiene una lente compuesta de vidrio de uno o varios elementos. Normalmente habrá alrededor de tres lentes objetivo atornillados en una pieza nasal circular que se puede girar para seleccionar el lente objetivo requerido. Estas disposiciones están diseñadas para ser parafocales , lo que significa que cuando uno cambia de una lente a otra en un microscopio, la muestra permanece enfocada . Los objetivos del microscopio se caracterizan por dos parámetros, a saber, aumento y apertura numérica . El primero suele oscilar entre 5× y 100×, mientras que el segundo oscila entre 0,14 y 0,7, correspondientes a distancias focales de aproximadamente 40 a 2 mm, respectivamente. Las lentes objetivas con mayores aumentos normalmente tienen una apertura numérica más alta y una profundidad de campo más corta en la imagen resultante. Algunas lentes objetivas de alto rendimiento pueden requerir oculares compatibles para ofrecer el mejor rendimiento óptico.
Algunos microscopios utilizan objetivos de inmersión en aceite o objetivos de inmersión en agua para obtener una mayor resolución con un gran aumento. Estos se utilizan con material de coincidencia de índices, como aceite de inmersión o agua, y un cubreobjetos compatible entre la lente del objetivo y la muestra. El índice de refracción del material de coincidencia de índices es mayor que el del aire, lo que permite que la lente del objetivo tenga una apertura numérica mayor (mayor que 1), de modo que la luz se transmita desde la muestra a la cara exterior de la lente del objetivo con una refracción mínima. Se pueden lograr aperturas numéricas de hasta 1,6. [28] La mayor apertura numérica permite la recolección de más luz, haciendo posible la observación detallada de detalles más pequeños. Una lente de inmersión en aceite suele tener un aumento de 40 a 100 ×.
Las perillas de ajuste mueven el escenario hacia arriba y hacia abajo con ajuste separado para enfoque grueso y fino. Los mismos controles permiten que el microscopio se ajuste a muestras de diferente espesor. En diseños de microscopios más antiguos, las ruedas de ajuste de enfoque mueven el tubo del microscopio hacia arriba o hacia abajo en relación con el soporte y tenían una platina fija.
El conjunto del conjunto óptico va tradicionalmente unido a un brazo rígido, que a su vez va unido a un robusto pie en forma de U para aportar la rigidez necesaria. El ángulo del brazo puede ser ajustable para permitir ajustar el ángulo de visión.
El marco proporciona un punto de montaje para varios controles del microscopio. Normalmente, esto incluirá controles para el enfoque, normalmente una rueda moleteada grande para ajustar el enfoque aproximado, junto con una rueda moleteada más pequeña para controlar el enfoque fino. Otras características pueden ser controles de lámpara y/o controles para ajustar el condensador.
El escenario es una plataforma debajo de la lente objetivo que sostiene la muestra que se está observando. En el centro del escenario hay un agujero por donde pasa la luz para iluminar el ejemplar. El escenario suele tener brazos para sujetar diapositivas (placas de vidrio rectangulares con unas dimensiones típicas de 25×75 mm, sobre las que se monta la muestra).
Con aumentos superiores a 100×, no resulta práctico mover una diapositiva con la mano. Una platina mecánica, típica de los microscopios de precio medio y alto, permite pequeños movimientos del portaobjetos mediante perillas de control que reposicionan la muestra/portaobjetos según se desee. Si un microscopio no tenía originalmente una platina mecánica, es posible agregar una.
Todas las etapas se mueven hacia arriba y hacia abajo para enfocarse. Con una plataforma mecánica, los portaobjetos se mueven sobre dos ejes horizontales para posicionar la muestra y examinar los detalles de la misma.
El enfoque comienza con un aumento más bajo para que el usuario centre la muestra en el escenario. Pasar a un aumento mayor requiere que la platina se mueva más verticalmente para volver a enfocar con el aumento mayor y también puede requerir un ligero ajuste de la posición horizontal de la muestra. Los ajustes de la posición horizontal de la muestra son la razón para tener una platina mecánica.
Debido a la dificultad de preparar muestras y montarlas en portaobjetos, para los niños es mejor comenzar con portaobjetos preparados que estén centrados y se enfoquen fácilmente independientemente del nivel de enfoque utilizado.
Se pueden utilizar muchas fuentes de luz. En su forma más sencilla, la luz del día se dirige a través de un espejo . Sin embargo, la mayoría de los microscopios tienen su propia fuente de luz ajustable y controlable, a menudo una lámpara halógena , aunque la iluminación mediante LED y láser se está convirtiendo en una disposición cada vez más común. La iluminación Köhler suele estar presente en instrumentos más caros.
El condensador es una lente diseñada para enfocar la luz de la fuente de iluminación sobre la muestra. El condensador también puede incluir otras características, como un diafragma y/o filtros, para gestionar la calidad y la intensidad de la iluminación. Para técnicas de iluminación como campo oscuro , contraste de fase y microscopía de contraste de interferencia diferencial, se deben alinear con precisión componentes ópticos adicionales en la trayectoria de la luz.
La potencia o aumento real de un microscopio óptico compuesto es el producto de las potencias del ocular y la lente del objetivo. Por ejemplo, un aumento del ocular de 10x y un aumento del objetivo de 100x dan un aumento total de 1000×. Los entornos modificados, como el uso de aceite o luz ultravioleta, pueden aumentar la resolución y permitir detalles resueltos con aumentos superiores a 1000x.
Hay muchas técnicas disponibles que modifican la trayectoria de la luz para generar una imagen de contraste mejorado a partir de una muestra. Las principales técnicas para generar un mayor contraste a partir de la muestra incluyen luz con polarización cruzada , campo oscuro , contraste de fase e iluminación de contraste de interferencia diferencial . Una técnica reciente ( Sarfus ) combina luz de polarización cruzada y diapositivas específicas con contraste mejorado para la visualización de muestras nanométricas.
Los microscopios modernos permiten algo más que la simple observación de la imagen de luz transmitida de una muestra; Existen muchas técnicas que se pueden utilizar para extraer otros tipos de datos. La mayoría de ellos requieren equipo adicional además de un microscopio compuesto básico.
La microscopía óptica se utiliza ampliamente en microelectrónica, nanofísica, biotecnología, investigación farmacéutica, mineralogía y microbiología. [30]
La microscopía óptica se utiliza para el diagnóstico médico , denominándose histopatología cuando se trata de tejidos, o en pruebas de frotis sobre células libres o fragmentos de tejido.
En uso industrial, los microscopios binoculares son comunes. Aparte de las aplicaciones que necesitan una verdadera percepción de la profundidad , el uso de oculares dobles reduce la fatiga visual asociada con las largas jornadas de trabajo en una estación de microscopía. En determinadas aplicaciones, los microscopios de larga distancia de trabajo o de enfoque largo [31] son beneficiosos. Es posible que sea necesario examinar un artículo detrás de una ventana , o que los sujetos industriales puedan representar un peligro para el objetivo. Esta óptica se parece a los telescopios con capacidad de enfoque cercano. [32] [33]
Los microscopios de medición se utilizan para mediciones de precisión. Hay dos tipos básicos. Uno tiene una retícula graduada para permitir medir distancias en el plano focal. [34] El otro tipo (y más antiguo) tiene una mira simple y un mecanismo micrométrico para mover el sujeto en relación con el microscopio. [35]
Los microscopios portátiles muy pequeños han encontrado cierto uso en lugares donde un microscopio de laboratorio sería una carga. [36]
A muy grandes aumentos con luz transmitida, los objetos puntuales se ven como discos borrosos rodeados por anillos de difracción . Estos se denominan discos Airy . El poder de resolución de un microscopio se considera la capacidad de distinguir entre dos discos de Airy estrechamente espaciados (o, en otras palabras, la capacidad del microscopio para revelar detalles estructurales adyacentes como distintos y separados). Son estos impactos de la difracción los que limitan la capacidad de resolver detalles finos. El alcance y la magnitud de los patrones de difracción se ven afectados tanto por la longitud de onda de la luz (λ), los materiales refractivos utilizados para fabricar la lente del objetivo y la apertura numérica (NA) de la lente del objetivo. Existe por tanto un límite finito más allá del cual es imposible resolver puntos separados en el campo objetivo, conocido como límite de difracción . Suponiendo que las aberraciones ópticas en toda la configuración óptica sean insignificantes, la resolución d puede expresarse como:
Normalmente se supone una longitud de onda de 550 nm, que corresponde a la luz verde . Con aire como medio externo, el NA práctico más alto es 0,95, y con aceite, hasta 1,5. En la práctica, el valor más bajo de d que se puede obtener con lentes convencionales es de aproximadamente 200 nm. Un nuevo tipo de lente que utiliza dispersión múltiple de luz permitió mejorar la resolución por debajo de 100 nm. [37]
Hay múltiples técnicas disponibles para alcanzar resoluciones superiores al límite de luz transmitida descrito anteriormente. Las técnicas holográficas, descritas por Courjon y Bulabois en 1979, también son capaces de romper este límite de resolución, aunque la resolución estaba restringida en su análisis experimental. [38]
Hay más técnicas disponibles para el uso de muestras fluorescentes. Los ejemplos incluyen Vertico SMI , microscopía óptica de barrido de campo cercano que utiliza ondas evanescentes y agotamiento de emisiones estimuladas . En 2005, se describió como herramienta didáctica un microscopio capaz de detectar una sola molécula. [39]
A pesar de los importantes avances de la última década, las técnicas para superar el límite de difracción siguen siendo limitadas y especializadas.
Si bien la mayoría de las técnicas se centran en aumentos de la resolución lateral, también existen algunas técnicas que tienen como objetivo permitir el análisis de muestras extremadamente delgadas. Por ejemplo, los métodos sarfus colocan la muestra delgada sobre una superficie que mejora el contraste y, por lo tanto, permiten visualizar directamente películas de hasta 0,3 nanómetros.
El 8 de octubre de 2014 se concedió el Premio Nobel de Química a Eric Betzig , William Moerner y Stefan Hell por el desarrollo de la microscopía de fluorescencia de superresolución . [40] [41]
SMI (microscopía de iluminación espacialmente modulada) es un proceso óptico de luz de la ingeniería denominada función de dispersión de puntos (PSF). Estos son procesos que modifican el PSF de un microscopio de manera adecuada para aumentar la resolución óptica, maximizar la precisión de las mediciones de distancia de objetos fluorescentes que son pequeños en relación con la longitud de onda de la luz que los ilumina, o para extraer otros parámetros estructurales en el rango nanométrico. [42] [43]
SPDM (microscopía de distancia de precisión espectral), la tecnología básica de microscopía de localización es un proceso óptico de luz de microscopía de fluorescencia que permite mediciones de posición, distancia y ángulo en partículas "ópticamente aisladas" (por ejemplo, moléculas) muy por debajo del límite teórico de resolución para microscopía óptica. "Ópticamente aislado" significa que en un momento dado, sólo se registra una partícula/molécula dentro de una región de un tamaño determinado por la resolución óptica convencional (normalmente aproximadamente 200-250 nm de diámetro ). Esto es posible cuando todas las moléculas dentro de dicha región llevan diferentes marcadores espectrales (por ejemplo, diferentes colores u otras diferencias utilizables en la emisión de luz de diferentes partículas). [44] [45] [46] [47]
Muchos tintes fluorescentes estándar como GFP , tintes Alexa, tintes Atto, Cy2/Cy3 y moléculas de fluoresceína se pueden usar para microscopía de localización, siempre que estén presentes ciertas condiciones fotofísicas. Utilizando esta tecnología denominada SPDMphymod (fluoróforos físicamente modificables), una única longitud de onda láser de intensidad adecuada es suficiente para la nanoimagen. [48]
La microscopía de súper resolución 3D con tintes fluorescentes estándar se puede lograr mediante la combinación de microscopía de localización para tintes fluorescentes estándar SPDMphymod e iluminación estructurada SMI. [49]
El agotamiento estimulado de las emisiones es un ejemplo sencillo de cómo es posible una resolución más alta que supere el límite de difracción, pero tiene importantes limitaciones. STED es una técnica de microscopía de fluorescencia que utiliza una combinación de pulsos de luz para inducir fluorescencia en una pequeña subpoblación de moléculas fluorescentes en una muestra. Cada molécula produce un punto de luz de difracción limitada en la imagen, y el centro de cada uno de estos puntos corresponde a la ubicación de la molécula. Como el número de moléculas fluorescentes es bajo, es poco probable que los puntos de luz se superpongan y, por lo tanto, se pueden colocar con precisión. Luego, este proceso se repite muchas veces para generar la imagen. Stefan Hell, del Instituto Max Planck de Química Biofísica, recibió el décimo Premio Alemán del Futuro en 2006 y el Premio Nobel de Química en 2014 por su desarrollo del microscopio STED y las metodologías asociadas. [50]
Para superar las limitaciones que marca el límite de difracción de la luz visible se han diseñado otros microscopios que utilizan otras ondas.
Es importante señalar que las ondas de mayor frecuencia tienen una interacción limitada con la materia; por ejemplo, los tejidos blandos son relativamente transparentes a los rayos X, lo que da como resultado distintas fuentes de contraste y diferentes aplicaciones objetivo.
El uso de electrones y rayos X en lugar de luz permite una resolución mucho mayor: la longitud de onda de la radiación es más corta, por lo que el límite de difracción es menor. Para que la sonda de longitud de onda corta no sea destructiva, se ha propuesto y discutido ampliamente en la literatura el sistema de imágenes de haz atómico ( nanoscopio atómico ), pero aún no es competitivo con los sistemas de imágenes convencionales.
STM y AFM son técnicas de sonda de escaneo que utilizan una pequeña sonda que se escanea sobre la superficie de la muestra. La resolución en estos casos está limitada por el tamaño de la sonda; Las técnicas de micromecanizado pueden producir sondas con radios de punta de 5 a 10 nm.
Además, métodos como la microscopía electrónica o de rayos X utilizan un vacío o un vacío parcial, lo que limita su uso para muestras vivas y biológicas (con la excepción de un microscopio electrónico de barrido ambiental ). Las cámaras de muestras necesarias para todos estos instrumentos también limitan el tamaño de la muestra y la manipulación de la muestra es más difícil. El color no se puede ver en las imágenes creadas con estos métodos, por lo que se pierde parte de la información. Sin embargo, son esenciales a la hora de investigar efectos moleculares o atómicos, como el endurecimiento por envejecimiento en aleaciones de aluminio o la microestructura de polímeros .
