Microscopía de contraste de interferencia de fluorescencia

La microscopía de contraste de interferencia de fluorescencia (FLIC) es una técnica microscópica desarrollada para lograr una resolución z en la escala nanométrica.

La FLIC se produce siempre que los objetos fluorescentes se encuentran en las proximidades de una superficie reflectante (por ejemplo, una oblea de silicio). La interferencia resultante entre la luz directa y la reflejada conduce a una modulación de doble seno ² de la intensidad, I, de un objeto fluorescente en función de la distancia, h, por encima de la superficie reflectante. Esto permite realizar mediciones de altura en nanómetros .

El microscopio FLIC es adecuado para medir la topografía de una membrana que contiene sondas fluorescentes, por ejemplo, una bicapa lipídica artificial , una membrana de una célula viva o la estructura de proteínas marcadas con fluorescencia en una superficie.

Teoría óptica FLIC

Sistema general de dos capas

La teoría óptica que sustenta el FLIC fue desarrollada por Armin Lambacher y Peter Fromherz, quienes derivaron una relación entre la intensidad de fluorescencia observada y la distancia del fluoróforo a una superficie de silicio reflectante .

La intensidad de fluorescencia observada, , es el producto de la probabilidad de excitación por unidad de tiempo, , y la probabilidad de medir un fotón emitido por unidad de tiempo, . Ambas probabilidades son una función de la altura del fluoróforo sobre la superficie de silicio, por lo que la intensidad observada también será una función de la altura del fluoróforo. La disposición más simple a considerar es un fluoróforo incrustado en dióxido de silicio (índice de refracción ) a una distancia d de una interfaz con silicio (índice de refracción ). El fluoróforo es excitado por luz de longitud de onda y emite luz de longitud de onda . El vector unitario da la orientación del dipolo de transición de excitación del fluoróforo. es proporcional a la proyección al cuadrado del campo eléctrico local , , que incluye los efectos de la interferencia , en la dirección del dipolo de transición. El campo eléctrico local, , en el fluoróforo se ve afectado por la interferencia entre la luz incidente directa y la luz que se refleja en la superficie de silicio. La interferencia se cuantifica por la diferencia de fase dada por es el ángulo de la luz incidente con respecto a la normal del plano de silicio. La interferencia no solo modula , sino que la superficie de silicio no refleja perfectamente la luz incidente. Los coeficientes de Fresnel dan el cambio de amplitud entre una onda incidente y reflejada. Los coeficientes de Fresnel dependen de los ángulos de incidencia, y , los índices de refracción de los dos medios y la dirección de polarización . Los ángulos y pueden relacionarse mediante la Ley de Snell . Las expresiones para los coeficientes de reflexión son: TE se refiere al componente del campo eléctrico perpendicular al plano de incidencia y TM al componente paralelo (El plano incidente está definido por la normal al plano y la dirección de propagación de la luz). En coordenadas cartesianas , el campo eléctrico local es es el ángulo de polarización de la luz incidente con respecto al plano de incidencia. La orientación del dipolo de excitación es una función de su ángulo con la normal y acimutal con el plano de incidencia. Las dos ecuaciones anteriores para y se pueden combinar para obtener la probabilidad de excitación del fluoróforo por unidad de tiempo . Muchos de los parámetros utilizados anteriormente variarían en un experimento normal. La variación de los cinco parámetros siguientes se debe incluir en esta descripción teórica. ${\displaystyle I_{FLIC}}$ ${\displaystyle P_{ex}}$ ${\displaystyle P_{em}}$ ${\displaystyle n_{1}}$ ${\displaystyle n_{0}}$ ${\displaystyle \lambda _{ex}}$ ${\displaystyle \lambda _{em}}$ ${\displaystyle ''e_{ex}''}$ ${\displaystyle P_{ex}}$ ${\displaystyle F_{in}}$
${\displaystyle P_{ex}\propto \mid F_{in}\cdot e_{ex}\mid ^{2}}$
${\displaystyle F_{in}}$ ${\displaystyle \Phi _{in}}$
${\displaystyle \Phi _{in}={\frac {4\pi n_{1}d\cos \theta _{1}^{in}}{\lambda _{ex}}}}$
${\displaystyle \theta _{1}^{in}}$ ${\displaystyle F_{in}}$ ${\displaystyle \theta _{i}}$ ${\displaystyle \theta _{j}}$ ${\displaystyle \theta _{i}}$ ${\displaystyle \theta _{j}}$
${\displaystyle r_{ij}^{TE}={\frac {n_{i}\cos \theta _{i}-n_{j}\cos \theta _{j}}{n_{i}\cos \theta _{i}+n_{j}\cos \theta _{j}}}\quad r_{ij}^{TM}={\frac {n_{j}\cos \theta _{i}-n_{i}\cos \theta _{j}}{n_{j}\cos \theta _{i}+n_{i}\cos \theta _{j}}}}$

${\displaystyle F_{in}=\sin \gamma _{in}\left[{\begin{array}{c}0\\1+r_{10}^{TE}{\textit {e}}^{i\Phi _{in}}\\0\end{array}}\right]+\cos \gamma _{in}\left[{\begin{array}{c}\cos \theta _{1}^{in}(1-r_{10}^{TM}{\textit {e}}^{i\Phi _{in}})\\0\\\sin \theta _{1}^{in}(1+r_{10}^{TM}{\textit {e}}^{i\Phi _{in}})\end{array}}\right]}$
${\displaystyle \gamma _{in}}$ ${\displaystyle \theta _{ex}}$ ${\displaystyle \phi _{ex}}$
${\displaystyle {\textit {e}}_{ex}=\left[{\begin{array}{c}\cos \phi _{ex}\sin \theta _{ex}\\\sin \phi _{ex}\sin \theta _{ex}\\\cos \theta _{ex}\end{array}}\right]}$
${\displaystyle F_{in}}$ ${\displaystyle {\textit {e}}_{ex}}$ ${\displaystyle P_{ex}}$

• La coherencia de la luz de excitación
• El ángulo de incidencia ( ) de la luz de excitación ${\displaystyle \theta _{1}^{in}}$
• Ángulo de polarización ( ) de la luz de excitación ${\displaystyle \gamma _{in}}$
• El ángulo del dipolo de transición ( ) del fluoróforo ${\displaystyle \theta _{ex}}$
• La longitud de onda de la luz de excitación ( ) ${\displaystyle \lambda _{ex}}$

La proyección al cuadrado debe promediarse sobre estas cantidades para obtener la probabilidad de excitación . El promedio sobre los primeros 4 parámetros da ${\displaystyle \mid F_{in}\cdot e_{ex}\mid ^{2}}$ ${\displaystyle P_{ex}}$
${\displaystyle <\mid F_{in}\cdot e_{ex}\mid ^{2}>\propto \int \sin \theta _{1}^{in}d\theta _{1}^{in}A_{in}(\theta _{1}^{in})\times \int \sin \theta _{ex}d\theta _{ex}O(\theta _{ex})U_{ex}(\lambda _{in},\theta _{1}^{in}.\theta _{ex})}$ ${\displaystyle U_{ex}=\sin ^{2}\theta _{ex}\mid 1+r_{10}^{TE}{\textit {e}}^{i\Phi _{in}}\mid ^{2}+\sin ^{2}\theta _{ex}\cos ^{2}\theta _{1}^{in}\mid 1-r_{10}^{TM}{\textit {e}}^{i\Phi _{in}}\mid ^{2}+2\cos ^{2}\theta _{ex}\sin ^{2}\theta _{1}^{in}\mid 1+r_{10}^{TM}{\textit {e}}^{i\Phi _{in}}\mid ^{2}}$

Ejemplo de un gráfico de intensidad FLIC que muestra la intensidad relativa de fluorescencia medida en función de la distancia entre el fluoróforo y la superficie reflectante. Es posible que los picos no tengan la misma altura en un gráfico experimental real

Los factores de normalización no están incluidos. es una distribución del ángulo de orientación de los dipolos fluoróforos. El ángulo azimutal y el ángulo de polarización se integran analíticamente, por lo que ya no aparecen en la ecuación anterior. Para obtener finalmente la probabilidad de excitación por unidad de tiempo, la ecuación anterior se integra sobre la dispersión en la longitud de onda de excitación, teniendo en cuenta la intensidad y el coeficiente de extinción del fluoróforo . Los pasos para calcular son equivalentes a los anteriores en el cálculo, excepto que las etiquetas de los parámetros em se reemplazan con ex y in se reemplaza con out . La intensidad de fluorescencia resultante medida es proporcional al producto de la probabilidad de excitación y la probabilidad de emisión. ${\displaystyle O(\theta _{ex})}$ ${\displaystyle \phi _{ex}}$ ${\displaystyle \gamma _{in}}$ ${\displaystyle I(\lambda _{ex})}$ ${\displaystyle \epsilon (\lambda _{ex})}$
${\displaystyle P_{ex}\propto \int d\lambda _{ex}I(\lambda _{ex})\epsilon (\lambda _{ex})<\mid F_{in}\cdot e_{ex}\mid ^{2}>}$
${\displaystyle P_{em}}$ ${\displaystyle P_{ex}}$
${\displaystyle P_{em}\propto \int d\lambda _{em}\Phi _{det}(\lambda _{em}){\textit {f}}(\lambda _{em})<\mid F_{in}\cdot e_{ex}\mid ^{2}>}$

${\displaystyle I_{FLIC}\propto P_{ex}P_{em}}$
Es importante destacar que esta teoría determina una relación de proporcionalidad entre la intensidad de fluorescencia medida y la distancia del fluoróforo sobre la superficie reflectante. El hecho de que no sea una relación de igualdad tendrá un efecto significativo en el procedimiento experimental. ${\displaystyle I_{FLIC}}$

Configuración experimental

En un experimento FLIC, normalmente se utiliza una oblea de silicio como superficie reflectante. A continuación, se hace crecer térmicamente una capa de óxido sobre la oblea de silicio para que actúe como espaciador. Sobre el óxido se coloca la muestra marcada con fluorescencia, como una membrana lipídica, una célula o proteínas unidas a la membrana. Una vez construido el sistema de muestra, todo lo que se necesita es un microscopio de epifluorescencia y una cámara CCD para realizar mediciones de intensidad cuantitativas.

Este es un diagrama de un ejemplo de configuración experimental FLIC con silicio, tres capas de óxido y una bicapa lipídica marcada con fluorescencia (las estrellas amarillas representan fluoróforos).

El espesor del dióxido de silicio es muy importante para realizar mediciones precisas de FLIC. Como se mencionó anteriormente, el modelo teórico describe la intensidad relativa de fluorescencia medida en función de la altura del fluoróforo. La posición del fluoróforo no se puede leer simplemente a partir de una única curva FLIC medida. El procedimiento básico es fabricar la capa de óxido con al menos dos espesores conocidos (la capa se puede hacer con técnicas fotolitográficas y el espesor se puede medir por elipsometría ). Los espesores utilizados dependen de la muestra que se esté midiendo. Para una muestra con una altura de fluoróforo en el rango de 10 nm, el espesor de óxido de alrededor de 50 nm sería lo mejor porque la curva de intensidad de FLIC es más pronunciada aquí y produciría el mayor contraste entre las alturas de fluoróforo. El espesor de óxido por encima de unos pocos cientos de nanómetros podría ser problemático porque la curva comienza a difuminarse por la luz policromática y un rango de ángulos de incidencia. Se compara una relación de intensidades de fluorescencia medidas en diferentes espesores de óxido con la relación predicha para calcular la altura del fluoróforo por encima del óxido ( ). La ecuación anterior se puede resolver numéricamente para encontrar . Las imperfecciones del experimento, como la reflexión imperfecta, la incidencia anormal de la luz y la luz policromática tienden a difuminar las curvas de fluorescencia nítidas. La dispersión del ángulo de incidencia se puede controlar mediante la apertura numérica (NA). Sin embargo, dependiendo de la apertura numérica utilizada, el experimento producirá una buena resolución lateral (xy) o una buena resolución vertical (z), pero no ambas. Una NA alta (~1,0) proporciona una buena resolución lateral, que es mejor si el objetivo es determinar la topografía de largo alcance. Por otro lado, una NA baja (~0,001) proporciona una medición precisa de la altura z para determinar la altura de una molécula marcada con fluorescencia en un sistema. ${\displaystyle d_{\textit {f}},}$
${\displaystyle {\frac {I_{theory}(d_{1})}{I_{theory}(d_{0})}}={\frac {I_{exp}(d_{1}+d_{\textit {f}})}{I_{exp}(d_{0}+d_{\textit {f}})}}}$
${\displaystyle d_{\textit {f}}}$

Análisis

Ejemplo de datos experimentales recopilados para una muestra marcada con fluorescencia en 16 espesores de óxido. Al ajustar la curva a los 16 puntos de datos se obtendría la altura de los fluoróforos por encima de la superficie del óxido.

El análisis básico implica ajustar los datos de intensidad con el modelo teórico permitiendo que la distancia del fluoróforo sobre la superficie del óxido ( ) sea un parámetro libre. Las curvas FLIC se desplazan hacia la izquierda a medida que aumenta la distancia del fluoróforo sobre el óxido. suele ser el parámetro de interés, pero a menudo se incluyen otros parámetros libres para optimizar el ajuste. Normalmente se incluyen un factor de amplitud (a) y un término aditivo constante para el fondo (b). El factor de amplitud escala la intensidad relativa del modelo y el fondo constante desplaza la curva hacia arriba o hacia abajo para tener en cuenta la fluorescencia procedente de zonas desenfocadas, como la parte superior de una célula. Ocasionalmente, se permite que la apertura numérica (NA) del microscopio sea un parámetro libre en el ajuste. Los demás parámetros que entran en la teoría óptica, como diferentes índices de refracción, espesores de capa y longitudes de onda de la luz, se suponen constantes con cierta incertidumbre. Un chip FLIC puede estar hecho con terrazas de óxido de 9 o 16 alturas diferentes dispuestas en bloques. Después de capturar una imagen de fluorescencia, cada bloque de 9 o 16 terrazas produce una curva FLIC independiente que define un . El promedio se obtiene compilando todos los valores en un histograma. El error estadístico en el cálculo de proviene de dos fuentes: el error en el ajuste de la teoría óptica a los datos y la incertidumbre en el espesor de la capa de óxido. El error sistemático proviene de tres fuentes: la medición del espesor del óxido (generalmente mediante un elipsómetro), la medición de la intensidad de fluorescencia con el CCD y la incertidumbre en los parámetros utilizados en la teoría óptica. Se ha estimado que el error sistemático es de . ${\displaystyle d_{\textit {f}}}$ ${\displaystyle d_{\textit {f}}}$ ${\displaystyle d_{\textit {f}}}$ ${\displaystyle d_{\textit {f}}}$ ${\displaystyle d_{\textit {f}}}$
${\displaystyle d_{\textit {f}}}$ ${\displaystyle \sim 1nm}$

Referencias

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