La iluminación Köhler es un método de iluminación de muestras utilizado para microscopía óptica de luz transmitida y reflejada (transiluminada y epiiluminada) . La iluminación Köhler actúa para generar una iluminación uniforme de la muestra y garantiza que una imagen de la fuente de iluminación (por ejemplo, el filamento de una lámpara halógena ) no sea visible en la imagen resultante. La iluminación de Köhler es la técnica predominante para la iluminación de muestras en la microscopía óptica científica moderna. Requiere elementos ópticos adicionales que son más caros y pueden no estar presentes en microscopios ópticos más básicos.
Antes de la iluminación de Köhler, la iluminación crítica era la técnica predominante para la iluminación de muestras. La iluminación crítica tiene la principal limitación de que la imagen de la fuente de luz (normalmente una bombilla ) cae en el mismo plano que la imagen de la muestra, es decir, el filamento de la bombilla es visible en la imagen final. La imagen de la fuente de luz a menudo se denomina imagen del filamento . Por lo tanto, la iluminación crítica produce una iluminación desigual de la muestra; Las regiones brillantes en la imagen del filamento iluminan con más fuerza esas regiones de la muestra. La iluminación desigual no es deseable ya que puede introducir artefactos como reflejos y sombras en la imagen.
Se pueden usar varios métodos para difundir la imagen del filamento, incluida la reducción de la potencia de la fuente de luz o el uso de una bombilla de vidrio opalino o un difusor de vidrio opalino entre la bombilla y la muestra. Todos estos métodos son, hasta cierto punto, funcionales para reducir la desigualdad de la iluminación; sin embargo, todos reducen la intensidad de la iluminación y alteran el rango de longitudes de onda de luz que llegan a la muestra.
Para abordar estas limitaciones, August Köhler diseñó un método de iluminación que utiliza una imagen perfectamente desenfocada de la fuente de luz para iluminar la muestra. Este trabajo fue publicado en 1893 en el Zeitschrift für wissenschaftliche Mikroskopie [1] y pronto fue seguido por la publicación de una traducción al inglés en el Journal of the Royal Microscopical Society . [2]
La iluminación de Köhler también se ha desarrollado en el contexto de la óptica sin imágenes . [3]
La principal limitación de la iluminación crítica es la formación de una imagen de la fuente de luz en el plano de la imagen de la muestra. La iluminación Köhler soluciona este problema garantizando que la imagen de la fuente de luz esté perfectamente desenfocada en el plano de muestra y sus planos de imagen conjugados . En un diagrama de rayos del camino de la luz de iluminación, esto se puede ver como los rayos formadores de imágenes pasan paralelos a través de la muestra.
La iluminación Köhler requiere varios componentes ópticos para funcionar:
Estos componentes se encuentran en este orden entre la fuente de luz y la muestra y controlan la iluminación de la muestra. Las lentes colectoras/de campo actúan para recoger la luz de la fuente de luz y enfocarla en el plano del diafragma del condensador. La lente del condensador actúa proyectando esta luz, sin enfocarla, a través de la muestra. Este esquema de iluminación crea dos conjuntos de planos de imágenes conjugados, uno con la fuente de luz y sus imágenes y otro con la muestra y sus imágenes. Estos dos conjuntos de planos de imagen se encuentran en los siguientes puntos (ver imagen para números y letras):
La principal ventaja de la iluminación Köhler es la iluminación uniforme de la muestra. Esto reduce los artefactos de la imagen y proporciona un alto contraste de la muestra. La iluminación uniforme de la muestra también es fundamental para técnicas de iluminación avanzadas como la microscopía de contraste de fase y contraste de interferencia diferencial .
El ajuste del diafragma del condensador altera el contraste de la muestra . Además, alterar el tamaño del diafragma del condensador permite ajustar la profundidad de campo de la muestra alterando la apertura numérica efectiva del microscopio. El papel del diafragma del condensador es análogo a la apertura en fotografía , aunque el diafragma del condensador de un microscopio funciona controlando la iluminación de la muestra, mientras que la apertura de una cámara funciona controlando la iluminación del detector.
La alteración del diafragma del condensador permite ajustar libremente la cantidad de luz que ingresa a la muestra sin alterar las longitudes de onda de la luz presente, en contraste con la reducción de la potencia de la fuente de luz con iluminación crítica (que cambia la temperatura de color de la lámpara). Este ajuste siempre va acompañado de una alteración de la apertura numérica del sistema, como se indicó anteriormente, por lo que sigue siendo necesario el ajuste de la intensidad de la fuente de iluminación por otros medios.
Mediante el ajuste del diafragma de campo, la imagen de la apertura del diafragma de campo en el plano de muestra se ajusta a un tamaño ligeramente mayor que la región de la muestra de la que se forma la imagen (que corresponde a su vez a la parte de la imagen de muestra arrojada al tope de campo del ocular). ). Como el diafragma de campo, la muestra y el tope de campo del ocular se encuentran en planos de imagen conjugados , este ajuste permite que los rayos de iluminación llenen completamente el campo de visión del ocular, al tiempo que minimiza la cantidad de luz extraña que debe bloquear el tope de campo del ocular. Esta luz extraña se dispersa dentro del sistema y degrada el contraste.
Los microscopios que utilizan iluminación Köhler deben comprobarse periódicamente para comprobar su correcta alineación. El procedimiento de realineación prueba si los componentes ópticos correctos están enfocados en los dos conjuntos de planos de imagen conjugados; los planos de imagen de la fuente de luz y los planos de imagen de la muestra.
La alineación de los componentes ópticos en el plano de la imagen de la muestra generalmente se realiza cargando primero una muestra de prueba y enfocándola moviendo el objetivo o la muestra. Entonces el diafragma de campo se cierra parcialmente; Los bordes del diafragma deben estar en los mismos planos de imagen conjugados que la muestra y, por lo tanto, deben aparecer enfocados. El enfoque se puede ajustar subiendo o bajando las lentes del condensador y el diafragma. Finalmente, el diafragma de campo se vuelve a abrir hasta un poco más allá del campo de visión.
Para probar la alineación de los componentes en el plano de la imagen de la fuente de luz, se debe retirar el ocular para permitir la observación del plano de la imagen intermedio (la posición del diafragma del ocular), ya sea directamente o utilizando un telescopio de fase / lente Bertrand . La fuente de luz (p. ej. el filamento de la bombilla) y los bordes del diafragma del condensador deben aparecer enfocados. Cualquier componente óptico en el plano focal posterior del objetivo (por ejemplo, el anillo de fase para microscopía de contraste de fases) y en el diafragma del condensador (por ejemplo, el anillo para microscopía de contraste de fases) también debe aparecer enfocado.