La microscopía de plano multifocal ( MUM ), también conocida como microscopía multiplano o microscopía multifocal , es una forma de microscopía óptica que permite el seguimiento de la dinámica 3D en células vivas con alta resolución temporal y espacial al obtener imágenes simultáneamente de diferentes planos focales dentro de la muestra. [1] [2] [3] [4] En esta metodología, la luz recolectada de la muestra por una lente objetiva corregida al infinito se divide en dos caminos. [5] En cada camino, la luz dividida se enfoca en un detector que se coloca a una distancia calibrada específica de la lente del tubo. De esta manera, cada detector genera imágenes de un plano distinto dentro de la muestra. La primera configuración MUM desarrollada fue capaz de obtener imágenes de dos planos distintos dentro de la muestra. Sin embargo, la configuración se puede modificar para obtener imágenes de más de dos planos dividiendo aún más la luz en cada trayectoria de luz y enfocándola en detectores colocados a distancias calibradas específicas. Posteriormente se mejoró para obtener imágenes de hasta cuatro planos distintos. [6] [7] Para obtener imágenes de un mayor número de planos focales, se han desarrollado técnicas más simples basadas en ópticas de división de imágenes. Un ejemplo es el uso de un prisma de división de imágenes personalizado, que es capaz de capturar hasta 8 planos focales utilizando solo dos cámaras. [8] Mejor aún, se pueden utilizar divisores de haz parciales estándar disponibles en el mercado para construir el llamado prisma divisor en z que permite obtener imágenes simultáneas de 9 planos focales individuales utilizando una sola cámara. [9] [10] Otra técnica llamada microscopía multifocal (MFM) utiliza óptica difractiva de Fourier para obtener imágenes de hasta 25 planos focales. [11] [12]
La microscopía de fluorescencia de células vivas representa una herramienta importante en el estudio de los eventos de tráfico. El diseño del microscopio convencional está bien adaptado para obtener imágenes de la dinámica celular rápida en dos dimensiones, es decir, en el plano de enfoque. Sin embargo, las células son objetos tridimensionales y las vías de tráfico intracelular normalmente no están limitadas a un plano focal. Si la dinámica no se limita a un plano focal, la tecnología de microscopía de plano único convencional es inadecuada para estudios detallados de la dinámica intracelular rápida en tres dimensiones. Los enfoques clásicos basados en el cambio del plano focal a menudo no son eficaces en tales situaciones, ya que los dispositivos de enfoque son relativamente lentos en comparación con muchas de las dinámicas intracelulares. Además, el plano focal puede estar frecuentemente en el lugar equivocado en el momento equivocado, perdiendo así aspectos importantes de los acontecimientos dinámicos.
MUM se puede implementar en cualquier microscopio óptico estándar . Un ejemplo de implementación en un microscopio Zeiss es el siguiente. [13] Primero se conecta un adaptador de video dual Zeiss al puerto lateral de un microscopio Zeiss Axiovert 200. Luego se concatenan dos adaptadores de video dual Zeiss conectando cada uno de ellos a los puertos de salida del primer adaptador de video Zeiss. A cada uno de los adaptadores de vídeo concatenados, se conecta una cámara CCD de alta resolución mediante el uso de anillos espaciadores/montaje en C y un adaptador de acoplamiento de cámara mecanizado a medida. El espacio entre el puerto de salida del adaptador de vídeo y la cámara es diferente para cada cámara, lo que da como resultado que las cámaras obtengan imágenes en planos focales distintos.
Cabe mencionar que existen muchas formas de implementar MUM. La implementación mencionada ofrece varias ventajas como flexibilidad, facilidad de instalación y mantenimiento y capacidad de ajuste para diferentes configuraciones. Además, para varias aplicaciones es importante poder adquirir imágenes en diferentes colores en diferentes tiempos de exposición . Por ejemplo, para visualizar la exocitosis en TIRFM , es necesaria una adquisición muy rápida. Sin embargo, para obtener imágenes de un orgánulo estacionario marcado con fluorescencia en la célula, es necesaria una baja excitación para evitar el fotoblanqueo y, como resultado, la adquisición debe ser relativamente lenta. [14] En este sentido, la implementación anterior ofrece una gran flexibilidad, ya que se pueden usar diferentes cámaras para adquirir imágenes en diferentes canales.
Las técnicas modernas de microscopía han generado un gran interés en el estudio de los procesos celulares a nivel de molécula única. Los experimentos de una sola molécula superan los efectos promedio y, por lo tanto, proporcionan información a la que no se puede acceder mediante estudios masivos convencionales. Sin embargo, la localización y el seguimiento 3D de moléculas individuales plantea varios desafíos. Además de si se pueden capturar imágenes de una sola molécula mientras se somete a una dinámica 3D potencialmente altamente compleja, surge la pregunta de si se puede determinar o no la ubicación 3D de una sola molécula y con qué precisión se puede hacer.
Un obstáculo importante para la estimación de ubicación 3D de alta precisión es la escasa discriminación de profundidad de un microscopio estándar. [15] Incluso con un objetivo de alta apertura numérica , la imagen de una fuente puntual en un microscopio convencional no cambia apreciablemente si la fuente puntual se mueve varios cientos de nanómetros desde su posición de enfoque. Esto hace que sea extraordinariamente difícil determinar la posición axial, es decir, la posición z, de la fuente puntual con un microscopio convencional.
De manera más general, la microscopía cuantitativa de una sola molécula para muestras 3D plantea el mismo problema ya sea que la aplicación sea de localización/seguimiento o microscopía de superresolución como PALM, STORM, FPALM, dSTORM para aplicaciones 3D, es decir, la determinación de la ubicación de una sola molécula en tres dimensiones. [16] MUM ofrece varias ventajas. [17] En MUM, las imágenes de la fuente puntual se adquieren simultáneamente en diferentes niveles de enfoque. Estas imágenes brindan información adicional que se puede utilizar para restringir la posición z de la fuente puntual. Esta información restrictiva supera en gran medida el problema de discriminación de profundidad cerca del foco.
La medida de localización 3D proporciona una medida cuantitativa de la precisión con la que se puede determinar la ubicación de la fuente puntual . Un valor numérico pequeño de la medida de localización 3D implica una precisión muy alta en la determinación de la ubicación, mientras que un valor numérico grande de la medida de localización 3D implica una precisión muy pobre en la determinación de la ubicación. Para un microscopio convencional, cuando la fuente puntual está cerca del plano de enfoque, por ejemplo, z0 <= 250 nm, la medida de localización 3D predice una precisión muy pobre en la estimación de la posición z. Por tanto, en un microscopio convencional, resulta problemático realizar el seguimiento 3D cuando la fuente puntual está cerca del plano de enfoque.
Por otro lado, para una configuración MUM de dos planos, la medida de localización 3D predice una precisión consistentemente mejor que un microscopio convencional para un rango de valores z, especialmente cuando la fuente puntual está cerca del plano de enfoque. Una implicación inmediata de este resultado es que la ubicación z de la fuente puntual se puede determinar con relativamente el mismo nivel de precisión para un rango de valores z, lo que es favorable para el seguimiento 3D de partículas individuales .
En aplicaciones de imágenes de partículas individuales, la cantidad de fotones detectados en la etiqueta fluorescente juega un papel crucial en el análisis cuantitativo de los datos adquiridos. Actualmente, los experimentos de seguimiento de partículas se llevan a cabo normalmente en un microscopio invertido o vertical, en el que una única lente objetivo ilumina la muestra y también recoge la señal de fluorescencia de la misma. Tenga en cuenta que aunque la emisión de fluorescencia de la muestra se produce en todas las direcciones (es decir, por encima y por debajo de la muestra), el uso de un único objetivo en estas configuraciones de microscopio da como resultado la recogida de luz de un solo lado de la muestra. Incluso si se utiliza una lente objetivo de alta apertura numérica, no todos los fotones emitidos en un lado de la muestra pueden recolectarse debido al ángulo de recolección finito de la lente objetivo. Así, incluso en las mejores condiciones de obtención de imágenes, los microscopios convencionales recogen sólo una fracción de los fotones emitidos por la muestra.
Para abordar este problema, se puede utilizar una configuración de microscopio que utiliza dos lentes objetivo opuestos, donde uno de los objetivos está en una posición invertida y el otro objetivo está en una posición vertical. Esta configuración se denomina microscopía de plano multifocal de doble objetivo (dMUM). [18]