El corte y empalme de proteínas es una reacción intramolecular de una proteína particular en la que un segmento proteico interno (llamado inteína ) se elimina de una proteína precursora con una ligadura de proteínas externas C-terminales y N-terminales (llamadas exteínas ) en ambos lados. La unión de corte y empalme de la proteína precursora es principalmente una cisteína o una serina , que son aminoácidos que contienen una cadena lateral nucleofílica . Las reacciones de corte y empalme de proteínas que se conocen actualmente no requieren cofactores exógenos ni fuentes de energía como el trifosfato de adenosina (ATP) o el trifosfato de guanosina (GTP). Normalmente, el empalme se asocia únicamente con el empalme previo al ARNm . Esta proteína precursora contiene tres segmentos: una exteína N seguida de una inteína seguida de una exteína C. Una vez realizado el corte y empalme, la proteína resultante contiene la exteína N unida a la exteína C; este producto de empalme también se denomina exteína.
La primera inteína se descubrió en 1988 mediante la comparación de secuencias entre la ATPasa vacuolar de Neurospora crassa [1] y la zanahoria [2] (sin inteína) y el gen homólogo en la levadura (con inteína) que se describió por primera vez como un supuesto transportador de iones de calcio . [3] En 1990 Hirata et al. [4] demostraron que la secuencia adicional en el gen de la levadura se transcribía en ARNm y se eliminaba de la proteína huésped solo después de la traducción. Desde entonces, se han encontrado inteínas en los tres dominios de la vida (eucariotas, bacterias y arqueas) y en virus .
El corte y empalme de proteínas no se había previsto y sus mecanismos fueron descubiertos por dos grupos (Anraku [5] y Stevens [6] ) en 1990. Ambos descubrieron un Saccharomyces cerevisiae VMA1 en un precursor de una enzima vacuolar H + -ATPasa . La secuencia de aminoácidos de los extremos N y C correspondía al 70% de la secuencia de ADN de la de una H + -ATPasa vacuolar de otros organismos, mientras que la secuencia de aminoácidos de la posición central correspondía al 30% de la secuencia total de ADN de la nucleasa HO de levadura .
Muchos genes tienen segmentos codificadores de proteínas no relacionados insertados en diferentes posiciones. Por estas y otras razones, las inteínas (o más propiamente, los segmentos de genes que codifican las inteínas) a veces se denominan elementos genéticos egoístas , pero puede ser más exacto llamarlos parásitos . Según la visión de la evolución centrada en los genes, la mayoría de los genes son "egoístas" sólo en la medida en que compiten con otros genes o alelos , pero normalmente cumplen una función para los organismos, mientras que los "elementos genéticos parásitos", al menos inicialmente, no hacen una función. contribución positiva a la aptitud del organismo. [7] [8]
En diciembre de 2019, la base de datos UniProtKB contiene 188 entradas anotadas manualmente como inteínas, que van desde solo decenas de residuos de aminoácidos hasta miles. [9] La primera inteína se encontró codificada dentro del gen VMA de Saccharomyces cerevisiae . Posteriormente se encontraron en hongos ( ascomicetos , basidiomicetos , zigomicetos y quitridios ) y también en diversas proteínas. Se ha descrito que una proteína lejanamente relacionada con las inteínas conocidas que contienen proteínas, pero estrechamente relacionada con las proteínas erizo de metazoos, tiene la secuencia de inteínas de Glomeromycota . Muchas de las inteínas recientemente descritas contienen endonucleasas dirigidas y algunas de ellas aparentemente están activas. [10] La abundancia de inteína en los hongos indica una transferencia lateral de genes que contienen inteína. Mientras que en eubacterias y arqueas, actualmente se conocen 289 y 182 inteínas. No es sorprendente que la mayor parte de la inteína de las eubacterias y las arqueas se inserte en la proteína metabólica del ácido nucleico, como los hongos. [10]
Las inteínas varían mucho, pero muchas de las mismas proteínas que contienen inteínas se encuentran en varias especies. Por ejemplo, la proteína del factor 8 de procesamiento de ARNm ( Prp8 ), fundamental en el espliceosoma , tiene siete sitios de inserción de inteína diferentes en especies eucariotas. [11] El Prp8 que contiene inteína se encuentra más comúnmente en los hongos, pero también se observa en Amoebozoa , Chlorophyta , Capsaspora y Choanoflagellida . Muchas micobacterias contienen inteínas dentro de DnaB (helicasa replicativa bacteriana), RecA (ADN recombinasa bacteriana) y SufB ( proteína de ensamblaje de grupos FeS ). [12] [13] Existe una variedad notable dentro de la estructura y el número de inteínas DnaB, tanto dentro del género Mycobacterium como más allá. Curiosamente, el DnaB que contiene inteína también se encuentra en los cloroplastos de las algas. [14] Las proteínas que contienen inteína que se encuentran en las arqueas incluyen RadA (homólogo de RecA), RFC, PolB, RNR. [15] Muchas de las mismas proteínas que contienen inteínas (o sus homólogos) se encuentran en dos o incluso en los tres dominios de la vida. Las inteínas también se observan en los proteomas codificados por bacteriófagos y virus eucariotas. Los virus pueden haber estado involucrados como vectores de distribución de inteína en una amplia variedad de organismos que contienen inteína. [15]
El proceso para las inteínas de clase 1 comienza con un cambio de NO o NS cuando la cadena lateral del primer residuo (una serina , treonina o cisteína ) de la porción de inteína de la proteína precursora ataca nucleófilamente el enlace peptídico del residuo inmediatamente arriba (que es decir, el residuo final de la N-exteína) para formar un intermedio éster (o tioéster ) lineal. Una transesterificación ocurre cuando la cadena lateral del primer residuo de la exteína C ataca al (tio)éster recién formado para liberar el extremo N-terminal de la inteína. Esto forma un intermediario ramificado en el que la exteína N y la exteína C están unidas, aunque no a través de un enlace peptídico. El último residuo de la inteína es siempre una asparagina (Asn), y el átomo de nitrógeno amida de esta cadena lateral escinde el enlace peptídico entre la inteína y la exteína C, dando como resultado un segmento de inteína libre con una imida cíclica terminal . Finalmente, el grupo amino libre de la exteína C ahora ataca al (tio)éster que une las exteínas N y C. Un cambio ON o SN produce un enlace peptídico y la proteína ligada funcional . [dieciséis]
Las inteínas de clase 2 no tienen una primera cadena lateral nucleofílica, solo una alanina. En cambio, la reacción comienza directamente con un desplazamiento nucleofílico, con el primer residuo de la exteína C uniendo el péptido carboxilo al residuo final de la exteína N. El resto procede como de costumbre, empezando por que Asn se convierta en una imida cíclica. [17]
Las inteínas de clase 3 no tienen una primera cadena lateral nucleofílica, sólo una alanina, pero tienen un motivo "WCT" interno no contiguo. El residuo interno C (cisteína) ataca al péptido carboxilo en el residuo final de la N-exteína (desplazamiento nucleofílico). La transesterificación ocurre cuando el primer residuo de la exteína C ataca al tioéster recién formado. El resto procede como de costumbre. [18]
El mecanismo para el efecto de empalme es una analogía natural con la técnica para generar químicamente proteínas de tamaño mediano llamada ligación química nativa .
Una inteína es un segmento de una proteína que es capaz de escindirse y unir las porciones restantes (las exteínas ) con un enlace peptídico durante el empalme de la proteína. [19] Las inteínas también han sido llamadas intrones de proteínas , por analogía con los intrones (ARN) .
La primera parte del nombre de una inteína se basa en el nombre científico del organismo en el que se encuentra, y la segunda parte se basa en el nombre del gen o exteína correspondiente. Por ejemplo, la inteína que se encuentra en Thermoplasma acidophilum y asociada con la subunidad A de la ATPasa vacuolar (VMA) se llama "Tac VMA".
Normalmente, como en este ejemplo, bastan sólo tres letras para especificar el organismo, pero existen variaciones. Por ejemplo, se pueden agregar letras adicionales para indicar una cepa. Si más de una inteína está codificada en el gen correspondiente, a las inteínas se les asigna un sufijo numérico que comienza de 5 ′ a 3 ′ o en orden de identificación (por ejemplo, "Msm dnaB-1").
El segmento del gen que codifica la inteína suele recibir el mismo nombre que la inteína, pero para evitar confusiones, el nombre de la inteína propiamente dicha suele escribirse en mayúscula ( p. ej. , Pfu RIR1-1), mientras que el nombre del segmento del gen correspondiente es en cursiva ( p. ej. , Pfu rir1-1 ). Una convención de eliminación de ambigüedades diferente es colocar una "i" minúscula después del nombre de la proteína fuente, por ejemplo, "Msm DnaBi1". [20]
Los intestinos se pueden clasificar según muchos criterios.
Las inteínas pueden contener un dominio del gen de la endonucleasa homing (HEG) además de los dominios de empalme. Este dominio es responsable de la propagación de la inteína al escindir el ADN en un alelo libre de inteína en el cromosoma homólogo , lo que desencadena el sistema de reparación de roturas de doble cadena del ADN (DSBR), que luego repara la rotura, copiando así el ADN que codifica la inteína. en un sitio previamente libre de inteína. [17] El dominio HEG no es necesario para el empalme de inteínas, por lo que puede perderse, formando una inteína mínima o mini . Varios estudios han demostrado la naturaleza modular de las inteínas agregando o eliminando dominios HEG y determinando la actividad de la nueva construcción. [ cita necesaria ]
En ocasiones, el intestino de la proteína precursora proviene de dos genes. En este caso, se dice que el intein es un intein dividido . Por ejemplo, en las cianobacterias , DnaE , la subunidad catalítica α de la ADN polimerasa III , está codificada por dos genes separados, dnaE-n y dnaE-c . El producto dnaE-n consta de una secuencia de N-exteína seguida de una secuencia de inteína 123-AA, mientras que el producto dnaE-c consta de una secuencia de inteína 36-AA seguida de una secuencia de exteína C. [21]
Las inteínas son muy eficientes en el empalme de proteínas y, en consecuencia, han encontrado un papel importante en la biotecnología . Hay más de 200 intestinos identificados hasta la fecha; Los tamaños varían entre 100 y 800 AA . Las inteínas han sido diseñadas para aplicaciones particulares como la semisíntesis de proteínas [22] y el etiquetado selectivo de segmentos de proteínas, lo cual es útil para estudios de RMN de proteínas grandes. [23]
La inhibición farmacéutica de la escisión del intestino puede ser una herramienta útil para el desarrollo de fármacos ; la proteína que contiene la inteína no realizará su función normal si la inteína no se escinde, ya que su estructura quedará alterada.
Se ha sugerido que las inteínas podrían resultar útiles para lograr la expresión alotópica de ciertas proteínas altamente hidrofóbicas normalmente codificadas por el genoma mitocondrial , por ejemplo en la terapia génica . [24] La hidrofobicidad de estas proteínas es un obstáculo para su importación a las mitocondrias. Por lo tanto, la inserción de una inteína no hidrófoba puede permitir que se lleve a cabo esta importación. La escisión del intestino después de la importación restauraría la proteína al tipo salvaje .
Las etiquetas de afinidad se han utilizado ampliamente para purificar proteínas recombinantes, ya que permiten la acumulación de proteínas recombinantes con pocas impurezas. Sin embargo, las proteasas deben eliminar la etiqueta de afinidad en el paso de purificación final. El paso de proteólisis adicional plantea los problemas de la especificidad de la proteasa al eliminar las etiquetas de afinidad de la proteína recombinante y la eliminación del producto de la digestión. Este problema se puede evitar fusionando una etiqueta de afinidad con intestinos autoescindibles en un entorno controlado. La primera generación de vectores de expresión de este tipo utilizó la inteína VMA (Sce VMA) de Saccharomyces cerevisiae modificada. Chong et al. [25] utilizaron un dominio de unión a quitina (CBD) de Bacillus circulans como etiqueta de afinidad y fusionaron esta etiqueta con una inteína Sce VMA modificada. La inteína modificada sufre una reacción de autoescisión en su enlace peptídico N-terminal con 1,4-ditiotreitol (DTT), β-mercaptoetanol (β-ME) o cistina a bajas temperaturas en un amplio rango de pH. Después de expresar la proteína recombinante, el homogeneizado celular se pasa a través de la columna que contiene quitina . Esto permite que el CBD de la proteína quimérica se una a la columna. Además, cuando se reduce la temperatura y las moléculas descritas anteriormente pasan a través de la columna, la proteína quimérica sufre un autoempalme y solo se eluye la proteína diana. Esta novedosa técnica elimina la necesidad de un paso de proteólisis y el Sce VMA modificado permanece en la columna adherido a la quitina a través del CBD. [25]
Recientemente se han utilizado inteínas para purificar proteínas basadas en péptidos autoagregantes. Los polipéptidos similares a la elastina (ELP) son una herramienta útil en biotecnología. Fusionados con la proteína objetivo, tienden a formar agregados dentro de las células. [26] Esto elimina el paso cromatográfico necesario en la purificación de proteínas. Las etiquetas ELP se han utilizado en la proteína de fusión de inteína, de modo que los agregados se pueden aislar sin cromatografía (por centrifugación) y luego la inteína y la etiqueta se pueden escindir de manera controlada para liberar la proteína objetivo en solución. Este aislamiento de proteínas se puede realizar utilizando un flujo de medios continuo, lo que produce grandes cantidades de proteínas, lo que hace que este proceso sea más eficiente económicamente que los métodos convencionales. [26] Otro grupo de investigadores utilizó etiquetas autoagregantes más pequeñas para aislar la proteína objetivo. Se usaron pequeños péptidos anfipáticos 18A y ELK16 (figura 5) para formar proteína agregante autoescindible. [27]
Durante los últimos veinte años, ha habido un interés creciente en aprovechar las inteínas para aplicaciones antimicrobianas . [12] El empalme de inteína se encuentra exclusivamente en organismos unicelulares, con una abundancia particularmente alta en microorganismos patógenos. [28] Además, las inteínas se encuentran comúnmente dentro de las proteínas de mantenimiento y/o proteínas involucradas en la supervivencia del organismo dentro de un huésped humano. La eliminación de la inteína postraduccional es necesaria para que la proteína se pliegue y funcione correctamente. Por ejemplo, Gaëlle Huet et al. demostró que en Mycobacterium tuberculosis , el SufB sin empalmar previene la formación del complejo SufBCD, un componente de la maquinaria SUF. [29] Como tal, la inhibición del empalme de inteínas puede servir como una poderosa plataforma para el desarrollo de antimicrobianos.
La investigación actual sobre los inhibidores del empalme de inteínas se ha centrado en el desarrollo de antimicobacterianos ( M. tb. tiene tres proteínas que contienen inteínas), así como agentes activos contra los hongos patógenos Cryptococcus y Aspergillus. [13] El cisplatino y compuestos similares que contienen platino inhiben el empalme de M. tb. RecA inteína mediante la coordinación con residuos catalíticos. [30] Los cationes divalentes, como los iones de cobre (II) y zinc (II), funcionan de manera similar para inhibir reversiblemente el empalme. [12] Sin embargo, ninguno de estos métodos es actualmente adecuado para un antibiótico eficaz y seguro. La inteína fúngica Prp8 también es inhibida por cationes divalentes y cisplatino al interferir con el residuo catalítico Cys1. [12] En 2021, Li et al. demostraron que los inhibidores de moléculas pequeñas del empalme de la inteína Prp8 eran selectivos y eficaces para ralentizar el crecimiento de C. neoformans y C. gattii , proporcionando evidencia interesante sobre el potencial antimicrobiano de los inhibidores del empalme de la inteína. [31]