La ligadura química nativa (NCL) es una extensión importante del concepto de ligación química para construir una cadena polipeptídica más grande mediante la condensación covalente de dos o más segmentos peptídicos desprotegidos. [1] La ligadura química nativa es el método más eficaz para sintetizar proteínas nativas o modificadas de tamaño típico ( es decir , proteínas <~300 AA). [2]
En la ligación química nativa, el grupo tiol ionizado de un residuo de cisteína N-terminal de un péptido desprotegido ataca al tioéster C-terminal de un segundo péptido desprotegido, en un tampón acuoso a pH 7,0 y temperatura ambiente. Esta etapa de transtioesterificación es reversible en presencia de un catalizador de ariltiol, lo que hace que la reacción sea tanto quimioselectiva como regioselectiva, y conduce a la formación de un intermedio unido a tioéster. El intermedio se reordena rápida y espontáneamente mediante un desplazamiento intramolecular de S,N-acilo que da como resultado la formación de un enlace amida nativo (" péptido ") en el sitio de ligación (esquema 1).
Observaciones:
El paso inicial de transtioesterificación de la reacción de ligación química nativa está catalizado por aditivos tiol. El catalizador de tiol más eficaz y comúnmente utilizado es el ácido 4-mercaptofenilacético (MPAA), (ref).
La característica clave de la ligadura química nativa de péptidos desprotegidos es la reversibilidad del primer paso , la reacción de intercambio tiol(ato)-tioéster. La ligadura química nativa es exquisitamente regioselectiva porque el paso de intercambio tiol(ato)-tioéster es libremente reversible en presencia de un catalizador de ariltiol agregado. Los altos rendimientos del producto de ligación final obtenidos, incluso en presencia de residuos de Cys internos en uno o ambos segmentos, son el resultado de la irreversibilidad de la segunda etapa de formación de amida (desplazamiento de acilo de S a N) en las condiciones de reacción utilizadas. .
No se forman productos secundarios a partir de la reacción con los otros grupos funcionales presentes en ninguno de los segmentos peptídicos (p. ej., ácidos carboxílicos de cadena lateral Asp, Glu; grupo amino Lys épsilon; hidroxilo fenólico Tyr; hidroxilos Ser, Thr, etc.).
En 1992, Stephen Kent y Martina Schnölzer del Instituto de Investigación Scripps desarrollaron el concepto de "ligadura química", el primer método práctico para condensar covalentemente segmentos peptídicos desprotegidos; La característica clave de la ligadura química es la formación de un enlace no natural en el sitio de ligación. Sólo dos años más tarde, en 1994, Philip Dawson, Tom Muir y Stephen Kent informaron sobre la "Ligación química nativa", una extensión del concepto de ligación química a la formación de un enlace amida nativo ('péptido') después de que la condensación nucleofílica inicial formara un tioéster. Producto de condensación enlazado diseñado para reorganizarse espontáneamente con el enlace amida nativo en el sitio de ligación.
Theodor Wieland y sus colaboradores habían informado del cambio de acilo S a N ya en 1953, cuando se demostró que la reacción de valina -tioéster y aminoácido cisteína en tampón acuoso producía el dipéptido valina-cisteína. [3] La reacción se desarrolló mediante la intermediación de un tioéster que contenía el azufre del residuo de cisteína. Sin embargo, el trabajo de Wieland NO condujo al desarrollo de la reacción de ligación química nativa. Más bien, el estudio de las reacciones de los tioésteres de aminoácidos llevó a Wieland y otros a desarrollar el método del "éster activo" para la síntesis de segmentos peptídicos protegidos mediante métodos químicos convencionales realizados en disolventes orgánicos.
La ligadura química nativa forma la base de la síntesis química de proteínas moderna y se ha utilizado para preparar numerosas proteínas y enzimas mediante síntesis química total. La ventaja del método de ligadura química nativa es que el acoplamiento de péptidos largos mediante esta técnica suele ser casi cuantitativo y proporciona acceso sintético a péptidos y proteínas grandes que de otro modo serían imposibles de producir, debido a su gran tamaño, decoración mediante modificación postraduccional y que contienen sustancias no químicas. -aminoácido codificado u otros componentes químicos.
La ligadura química nativa es inherentemente "verde" en su economía atómica y su uso de solventes benignos. Implica la reacción de un tioéster peptídico desprotegido con un segundo péptido desprotegido que tiene un residuo de cisteína N-terminal. Se lleva a cabo en solución acuosa a pH neutro, normalmente en clorhidrato de guanidina 6 M, en presencia de un catalizador de ariltiol y normalmente proporciona rendimientos casi cuantitativos del producto de ligación deseado.
Los tioésteres de péptidos se pueden preparar directamente mediante Boc Chemistry SPPS ; sin embargo, los péptidos que contienen tioésteres no son estables al tratamiento con una base nucleófila, lo que impide la síntesis directa de tioésteres de péptidos mediante SPPS de química Fmoc . Las técnicas de síntesis de péptidos en fase sólida de química Fmoc para generar tioésteres de péptidos se basan en la síntesis de hidrazidas de péptidos que se convierten en tioésteres de péptidos de forma postsintética.
Los tioésteres del polipéptido C-terminal también se pueden producir in situ , utilizando los llamados sistemas de desplazamiento N,S -acilo. A esta familia pertenece el grupo bis (2-sulfaniletil)amido, también llamado grupo SEA. Las bis (2-sulfaniletil)amidas del polipéptido C-terminal (segmentos peptídicos SEA) reaccionan con el péptido Cys para dar un enlace peptídico nativo como en NCL. Esta reacción, que se denomina ligadura de péptidos nativos SEA , es una variante útil de la ligadura química nativa. [4]
Al producir segmentos peptídicos que contienen un residuo de cisteína N-terminal, se debe evitar la exposición a cetonas, ya que éstas pueden bloquear la cisteína N-terminal. No utilice grupos protectores que liberen aldehídos o cetonas . Por la misma razón, se debe evitar el uso de acetona , particularmente en el lavado de cristalería utilizada para liofilización .
Una característica de la técnica de ligación química nativa es que la cadena polipeptídica producto contiene cisteína en el sitio de ligación. La cisteína en el sitio de ligación se puede desulfurar a alanina , ampliando así la gama de posibles sitios de ligación para incluir residuos de alanina. Se pueden usar otros aminoácidos que contienen beta-tiol para la ligación química nativa, seguida de la desulfuración. Alternativamente, se pueden usar auxiliares de ligadura que contienen tiol que imitan una cisteína N-terminal para la reacción de ligadura, pero que se pueden eliminar después de la síntesis. El uso de auxiliares que contienen tiol puede no ser tan eficaz como la ligación en un residuo Cys. La ligadura química nativa también se puede realizar con un residuo de selenocisteína N-terminal. [5]
Los tioésteres C-terminales del polipéptido producidos mediante técnicas de ADN recombinante pueden hacerse reaccionar con un polipéptido que contiene Cys N-terminal mediante la misma química de ligación nativa para proporcionar proteínas semisintéticas muy grandes. La ligación química nativa de este tipo utilizando un segmento de polipéptido recombinante se conoce como ligación de proteínas expresadas. De manera similar, una proteína recombinante que contiene una Cys N-terminal se puede hacer reaccionar con un tioéster de polipéptido sintético . Por tanto, la ligación química nativa se puede utilizar para introducir segmentos sintetizados químicamente en proteínas recombinantes, independientemente de su tamaño.
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