La liofilización , también conocida como liofilización o criodesecación , es un proceso de deshidratación a baja temperatura [1] que consiste en congelar el producto y bajar la presión, eliminando así el hielo mediante sublimación . [2] Esto contrasta con la deshidratación mediante la mayoría de los métodos convencionales que evaporan el agua mediante calor. [3]
Debido a la baja temperatura utilizada en el procesamiento, [1] el producto rehidratado conserva gran parte de sus cualidades originales. Cuando se liofilizan objetos sólidos como las fresas, se mantiene la forma original del producto. [4] Si el producto a secar es un líquido, como se ve a menudo en aplicaciones farmacéuticas, las propiedades del producto final se optimizan mediante la combinación de excipientes (es decir, ingredientes inactivos). Las aplicaciones principales de la liofilización incluyen biológicas (p. ej., bacterias y levaduras), biomédicas (p. ej., trasplantes quirúrgicos), procesamiento de alimentos (p. ej., café) y conservación . [1]
Los incas liofilizaban patatas para convertirlas en chuño desde el siglo XIII. El proceso implicó múltiples ciclos de exponer las papas a temperaturas bajo cero en los picos de las montañas de los Andes durante la noche, y exprimirlas y secarlas a la luz del sol durante el día. [5] El pueblo inca también utilizó el clima único del Altiplano para congelar carne seca. [6]
La liofilización moderna comenzó ya en 1890 por Richard Altmann , quien ideó un método para congelar tejidos secos (ya sean vegetales o animales), pero pasó prácticamente desapercibido hasta la década de 1930. [7] En 1909, LF Shackell creó de forma independiente la cámara de vacío utilizando una bomba eléctrica. [8] No se documentó más información sobre liofilización hasta que Tival en 1927 y Elser en 1934 patentaron sistemas de liofilización con mejoras en los pasos de congelación y condensación. [8]
Un importante punto de inflexión para la liofilización se produjo durante la Segunda Guerra Mundial , cuando se necesitaba plasma sanguíneo y penicilina para tratar a los heridos en el campo. Debido a la falta de transporte refrigerado, muchos suministros de suero se estropearon antes de llegar a sus destinatarios. [8] El proceso de liofilización se desarrolló como una técnica comercial que permitía que el plasma sanguíneo y la penicilina se volvieran químicamente estables y viables sin refrigeración. [8] En las décadas de 1950 y 1960, la liofilización comenzó a ser vista como una herramienta multipropósito tanto para el procesamiento de productos farmacéuticos como de alimentos. [8]
Los alimentos liofilizados se convirtieron en un componente importante de las raciones militares y de astronautas . Lo que comenzó para las tripulaciones de astronautas como comidas en tubos y refrigerios liofilizados que eran difíciles de rehidratar, [9] se transformó en comidas calientes en el espacio al mejorar el proceso de rehidratación de las comidas liofilizadas con agua. [9] A medida que la tecnología y el procesamiento de alimentos mejoraron, la NASA buscó formas de proporcionar un perfil de nutrientes completo y al mismo tiempo reducir las migajas, las bacterias que producen enfermedades y las toxinas. [10] El perfil nutricional completo se mejoró con la adición de un aceite vegetal a base de algas para agregar ácidos grasos poliinsaturados. [10] Los ácidos grasos poliinsaturados son beneficiosos para el desarrollo mental y de la visión y, como permanecen estables durante los viajes espaciales, pueden proporcionar a los astronautas beneficios adicionales. [10] El problema de las migas se resolvió añadiendo una capa de gelatina a los alimentos para fijarlos y evitar que se formaran migas. [9] Las bacterias y toxinas productoras de enfermedades se redujeron mediante el control de calidad y el desarrollo del plan de Análisis de Peligros y Puntos Críticos de Control (HACCP), que se utiliza ampliamente hoy en día para evaluar el material alimentario antes, durante y después del procesamiento. [10] Con la combinación de estas tres innovaciones, la NASA podría proporcionar alimentos seguros y saludables a sus tripulaciones a partir de comidas liofilizadas. [10]
Las raciones militares también han avanzado mucho, desde servir carne de cerdo curada y harina de maíz hasta filetes de ternera con salsa de champiñones. [11] La forma en que se eligen y elaboran las raciones se basa en la aceptación, la nutrición, la salubridad, la producibilidad, el costo y el saneamiento. [12] Los requisitos adicionales para las raciones incluyen una vida útil mínima de tres años, entregarse por vía aérea, consumirse en entornos de todo el mundo y proporcionar un perfil nutricional completo. [12] Las nuevas raciones en bandeja (Raciones T) se han mejorado al aumentar los artículos aceptables y proporcionar comidas de alta calidad mientras se está en el campo. El café liofilizado también se incorporó reemplazando al café secado por aspersión en la categoría de comida lista para comer . [12]
Hay cuatro etapas en el proceso completo de liofilización: pretratamiento, congelación, secado primario y secado secundario.
El pretratamiento incluye cualquier método de tratamiento del producto antes de su congelación. Esto puede incluir concentrar el producto, revisar la formulación (es decir, agregar componentes para aumentar la estabilidad, preservar la apariencia y/o mejorar el procesamiento), disminuir un solvente de alta presión de vapor o aumentar el área superficial. Los trozos de alimentos suelen recibir un tratamiento IQF para que fluyan libremente antes de la liofilización. Los productos farmacéuticos liofilizados son en la mayoría de los casos parenterales administrados después de la reconstitución mediante inyección que deben ser estériles y estar libres de partículas de impurezas. El pretratamiento en estos casos consiste en la preparación de la solución seguida de una filtración de varios pasos. Luego, el líquido se llena en condiciones estériles en los contenedores finales que, en los liofilizadores a escala de producción, se cargan automáticamente en los estantes.
En muchos casos, la decisión de pretratar un producto se basa en conocimientos teóricos sobre la liofilización y sus requisitos, o es exigida por consideraciones de tiempo de ciclo o calidad del producto. [13]
Durante la etapa de congelación, el material se enfría por debajo de su punto triple , temperatura a la que pueden coexistir las fases sólida, líquida y gaseosa del material. Esto garantiza que en los siguientes pasos se producirá la sublimación en lugar de la fusión. Para facilitar una liofilización más rápida y eficiente, son preferibles cristales de hielo más grandes. Los grandes cristales de hielo forman una red dentro del producto que promueve una eliminación más rápida del vapor de agua durante la sublimación. [2] Para producir cristales más grandes, el producto debe congelarse lentamente o puede subir y bajar la temperatura en un proceso llamado recocido . La fase de congelación es la más crítica de todo el proceso de liofilización, ya que el método de congelación puede afectar la velocidad de reconstitución, la duración del ciclo de liofilización, la estabilidad del producto y la cristalización adecuada. [14]
Los materiales amorfos no tienen un punto eutéctico , pero sí tienen un punto crítico , por debajo del cual el producto debe mantenerse para evitar la fusión [ se necesita más explicación ] o el colapso durante el secado primario y secundario.
En el caso de productos en los que se requiere la preservación de la estructura, como alimentos u objetos con células que antes estaban vivas, los grandes cristales de hielo rompen las paredes celulares, lo que da como resultado una textura cada vez más pobre y una pérdida de contenido nutritivo. En este caso, congelar rápidamente el material por debajo de su punto eutéctico evita la formación de grandes cristales de hielo. [2] Por lo general, las temperaturas bajo cero están entre −50 °C (−58 °F) y −80 °C (−112 °F).
Durante la fase de secado primario, la presión se reduce (hasta el rango de unos pocos milibares ) y se suministra suficiente calor al material para que el hielo se sublime . La cantidad de calor necesaria se puede calcular utilizando el calor latente de sublimación de las moléculas sublimantes . En esta fase inicial de secado, se sublima aproximadamente el 95% del agua del material. Esta fase puede ser lenta (puede durar varios días en la industria), ya que, si se añade demasiado calor, se podría alterar la estructura del material.
En esta fase, la presión se controla mediante la aplicación de vacío parcial . El vacío acelera la sublimación, lo que la hace útil como proceso de secado deliberado. Además, una cámara de condensador fría y/o placas de condensador proporcionan una superficie para que el vapor de agua se vuelva a licuar y solidifique.
Es importante señalar que, en este rango de presión, el calor se aporta principalmente por conducción o radiación; el efecto de convección es insignificante debido a la baja densidad del aire.
La fase de secado secundaria tiene como objetivo eliminar las moléculas de agua no congeladas , ya que el hielo se eliminó en la fase de secado primaria. Esta parte del proceso de liofilización se rige por las isotermas de adsorción del material . En esta fase, la temperatura se eleva más que en la fase de secado primario, pudiendo incluso estar por encima de los 0 °C, para romper las interacciones físico-químicas que se hayan formado entre las moléculas de agua y el material congelado. Por lo general, la presión también se reduce en esta etapa para estimular la desorción (generalmente en el rango de microbares o fracciones de pascal ). Sin embargo, hay productos que también se benefician de una mayor presión.
Una vez completado el proceso de liofilización, el vacío generalmente se rompe con un gas inerte, como nitrógeno, antes de sellar el material.
Al final de la operación, el contenido final de agua residual en el producto es extremadamente bajo, alrededor del 1-4%.
La liofilización causa menos daño a la sustancia que otros métodos de deshidratación que utilizan temperaturas más altas. Los factores nutrientes que son sensibles al calor se pierden menos en el proceso en comparación con los procesos que incorporan tratamiento térmico con fines de secado. [2] La liofilización no suele provocar contracción ni endurecimiento del material que se está secando. Además, los sabores, olores y contenido nutricional generalmente permanecen sin cambios, lo que hace que el proceso sea popular para conservar alimentos. Sin embargo, el agua no es la única sustancia química capaz de sublimarse , y la pérdida de otros compuestos volátiles como el ácido acético (vinagre) y los alcoholes puede producir resultados indeseables.
Los productos liofilizados se pueden rehidratar (reconstituir) mucho más rápida y fácilmente porque el proceso deja poros microscópicos. Los poros son creados por los cristales de hielo que se subliman dejando huecos o poros en su lugar. Esto es especialmente importante cuando se trata de usos farmacéuticos. La liofilización también se puede utilizar para aumentar la vida útil de algunos productos farmacéuticos durante muchos años.
Las compañías farmacéuticas suelen utilizar la liofilización para aumentar la vida útil de los productos, como vacunas de virus vivos, [15] productos biológicos, [16] y otros inyectables. Al eliminar el agua del material y sellarlo en un vial de vidrio , el material se puede almacenar, enviar y luego reconstituir fácilmente a su forma original para inyección. Otro ejemplo de la industria farmacéutica es el uso de la liofilización para producir tabletas u obleas, cuya ventaja es menos excipiente y una forma de dosificación de rápida absorción y fácil administración.
Los productos farmacéuticos liofilizados se producen como polvos liofilizados para su reconstitución en viales y, más recientemente, en jeringas precargadas para la autoadministración por parte del paciente.
Ejemplos de productos biológicos liofilizados incluyen muchas vacunas tales como la vacuna de virus vivo del sarampión, la vacuna contra la tifoidea y la vacuna meningocócica de polisacáridos de los grupos A y C combinados. Otros productos biológicos liofilizados incluyen el factor VIII antihemofílico , el interferón alfa , la estreptoquinasa, un medicamento anticoagulante , y el extracto alergénico de veneno de avispa. [17]
Muchos productos biofarmacéuticos basados en proteínas terapéuticas, como los anticuerpos monoclonales, requieren liofilización para su estabilidad. Ejemplos de productos biofarmacéuticos liofilizados incluyen medicamentos de gran éxito como etanercept ( Enbrel de Amgen ), infliximab (Remicade de Janssen Biotech ), rituximab y trastuzumab (Herceptin de Genentech ).
Los extractos celulares que respaldan aplicaciones de biotecnología sin células, como el diagnóstico en el lugar de atención y la biofabricación, también se liofilizan para mejorar la estabilidad en el almacenamiento a temperatura ambiente. [18] [19]
Los polvos secos de probióticos a menudo se producen mediante liofilización en masa de microorganismos vivos como bacterias del ácido láctico y bifidobacterias . [20]
Los productos biológicos liofilizados se pueden prensar en gránulos y tabletas para el almacenamiento de productos biológicos en estado sólido, anhidro y de alta densidad. [21]
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El objetivo principal de la liofilización dentro de la industria alimentaria es extender la vida útil de los alimentos manteniendo la calidad. [1] Se sabe que la liofilización da como resultado alimentos de la más alta calidad de todas las técnicas de secado porque se mantiene la integridad estructural junto con la preservación de los sabores. [1] Debido a que la liofilización es costosa, se utiliza principalmente con productos de alto valor . [4] Ejemplos de productos liofilizados de alto valor son las frutas y verduras de temporada debido a su disponibilidad limitada, el café; y alimentos utilizados para raciones militares, astronautas/cosmonautas y/o excursionistas. [4]
Debido a su peso ligero por volumen de alimento reconstituido, los productos liofilizados son populares y convenientes para los excursionistas , como raciones militares o comidas para astronautas. [1] Se puede transportar una mayor cantidad de comida seca respecto al mismo peso de comida húmeda. En reemplazo de los alimentos húmedos, los alimentos liofilizados se pueden rehidratar fácilmente con agua si se desea y la vida útil del producto seco es más larga que la del producto fresco/húmedo, lo que lo hace ideal para viajes largos realizados por excursionistas, personal militar o astronautas . El desarrollo de la liofilización aumentó la variedad de comidas y refrigerios para incluir productos como cóctel de camarones , pollo y verduras, pudín de caramelo y salsa de manzana . [9]
El café contiene cualidades de sabor y aroma que se crean debido a la reacción de Maillard durante el tostado [22] y se puede conservar mediante liofilización. [2] En comparación con otros métodos de secado, como el secado a temperatura ambiente, el secado con aire caliente y el secado solar, los granos de café Robusta liofilizados contenían mayores cantidades de aminoácidos esenciales como leucina, lisina y fenilalanina. [22] Además, se conservaron pocos aminoácidos no esenciales que contribuyeron significativamente al sabor. [22]
Con la deshidratación convencional, la calidad de las bayas puede degradarse ya que su estructura es delicada y contiene altos niveles de humedad. Se descubrió que las fresas tenían la más alta calidad cuando se liofilizaban; conservando el color, el sabor y la capacidad de rehidratarse. [23]
La liofilización se utiliza ampliamente para preservar insectos con fines de consumo. Los insectos enteros liofilizados se venden como alimento exótico para mascotas , alimento para pájaros, cebo para peces y, cada vez más, para consumo humano . [24] [25] Los insectos liofilizados en polvo se utilizan como base proteica en alimentos para animales y, en algunos mercados, como suplemento nutricional para uso humano. [25] [24] Los insectos cultivados generalmente se utilizan para todos los fines antes mencionados en comparación con la recolección de insectos silvestres, excepto en el caso de los saltamontes, que a menudo se cosechan en cultivos extensivos. [24]
En la síntesis química , los productos suelen liofilizarse para hacerlos más estables o más fáciles de disolver en agua para su uso posterior.
En las bioseparaciones, la liofilización también se puede utilizar como procedimiento de purificación de última etapa, porque puede eliminar eficazmente los disolventes. Además, es capaz de concentrar sustancias con pesos moleculares bajos que son demasiado pequeños para ser eliminados mediante una membrana de filtración . La liofilización es un proceso relativamente caro. El equipo es aproximadamente tres veces más caro que el equipo utilizado para otros procesos de separación, y las altas demandas de energía generan altos costos de energía. Además, la liofilización también tiene un tiempo de proceso largo, porque la adición de demasiado calor al material puede provocar fusión o deformaciones estructurales. Por lo tanto, la liofilización suele reservarse para materiales sensibles al calor, como proteínas , enzimas , microorganismos y plasma sanguíneo . La baja temperatura de funcionamiento del proceso provoca un daño mínimo a estos productos sensibles al calor.
En nanotecnología , la liofilización se utiliza para la purificación de nanotubos [26] para evitar la agregación debida a fuerzas capilares durante el secado por vaporización térmica regular.
La liofilización se encuentra entre los métodos utilizados para preservar animales en el campo de la taxidermia . Cuando los animales se conservan de esta manera se denominan "taxidermia liofilizada" o " montajes liofilizados ". La liofilización se utiliza comúnmente para preservar crustáceos , peces , anfibios , reptiles , insectos y mamíferos más pequeños . [27] La liofilización también se utiliza como medio para conmemorar a las mascotas después de su muerte. En lugar de optar por una montura de piel tradicional cuando eligen preservar a su mascota mediante taxidermia, muchos propietarios optan por la liofilización porque es menos invasiva para el cuerpo de la mascota. [28]
Organizaciones como el Laboratorio de Conservación de Documentos de la Administración Nacional de Archivos y Registros de los Estados Unidos (NARA) han realizado estudios sobre la liofilización como método de recuperación de libros y documentos dañados por el agua. [29] Si bien la recuperación es posible, la calidad de la restauración depende del material de los documentos. Si un documento está hecho de una variedad de materiales, que tienen diferentes propiedades de absorción, la expansión se producirá a un ritmo no uniforme, lo que podría provocar deformaciones. El agua también puede provocar que crezca moho o que las tintas sangren. En estos casos, la liofilización puede no ser un método de restauración eficaz.
En bacteriología la liofilización se utiliza para conservar cepas especiales .
Los procesos cerámicos avanzados a veces utilizan la liofilización para crear un polvo moldeable a partir de una suspensión pulverizada . La liofilización crea partículas más suaves con una composición química más homogénea que el secado por aspersión en caliente tradicional , pero también es más caro.
La empresa sueca Promessa Organic AB ha desarrollado una nueva forma de entierro que previamente liofiliza el cuerpo con nitrógeno líquido y la presenta como una alternativa respetuosa con el medio ambiente a los tradicionales entierros con ataúdes y cremaciones .
La liofilización se considera el método óptimo de elección para la deshidratación de alimentos debido a la preservación de la calidad, lo que significa que las características del producto alimenticio, como el aroma, la rehidratación y la bioactividad, son notablemente mayores en comparación con los alimentos secados mediante otras técnicas. [1]
La extensión de la vida útil resulta de las bajas temperaturas de procesamiento junto con la rápida transición del agua a través de la sublimación. [1] Con estas condiciones de procesamiento, se minimizan las reacciones de deterioro, incluido el pardeamiento no enzimático , el pardeamiento enzimático y la desnaturalización de proteínas . [1] Cuando el producto se seca con éxito, se empaqueta adecuadamente y se coloca en condiciones ideales de almacenamiento, los alimentos tienen una vida útil superior a 12 meses. [2]
Si un producto seco no se puede rehidratar fácil o completamente, se considera de menor calidad. Debido a que el producto liofilizado final es poroso, puede ocurrir una rehidratación completa en el alimento. [1] Esto significa una mayor calidad del producto y lo hace ideal para comidas instantáneas listas para comer . [4]
Debido a las bajas temperaturas de procesamiento y a la minimización de las reacciones de deterioro, se retienen los nutrientes y se mantiene el color. [2] La fruta liofilizada mantiene su forma original y tiene una textura suave y crujiente característica.
Dado que el principal método de descontaminación microbiana para la liofilización es el proceso de deshidratación a baja temperatura, los organismos de descomposición y los patógenos resistentes a estas condiciones pueden permanecer en el producto. Aunque el crecimiento microbiano se ve inhibido por las condiciones de baja humedad, aún pueden sobrevivir en el producto alimenticio. [30] Un ejemplo de esto es un brote viral de hepatitis A que ocurrió en los Estados Unidos en 2016, asociado con fresas congeladas. [31] Si el producto no se empaqueta y/o almacena adecuadamente, el producto puede absorber humedad, permitiendo que los patógenos una vez inhibidos también comiencen a reproducirse. [2]
La liofilización cuesta aproximadamente cinco veces más que el secado convencional, [4] por lo que es más adecuada para productos cuyo valor aumenta con el procesamiento. [2] Los costes también varían según el producto, el material de embalaje, la capacidad de procesamiento, etc. [4] El paso que consume más energía es la sublimación. [4]
El aceite de silicona es el fluido común que se utiliza para calentar o enfriar los estantes del liofilizador. El ciclo continuo de calor/enfriamiento puede provocar una fuga de aceite de silicona en las áreas débiles que conectan el estante y la manguera. Esto puede contaminar el producto y provocar grandes pérdidas de productos farmacéuticos y alimentarios. Por lo tanto, para evitar este problema, se utilizan espectrómetros de masas para identificar los vapores liberados por el aceite de silicona para tomar medidas correctivas de inmediato y evitar la contaminación del producto. [32]
Las células de mamíferos generalmente no sobreviven a la liofilización, aunque todavía se pueden conservar. [33] [34]
Hay muchos tipos de liofilizadores disponibles, sin embargo, generalmente contienen algunos componentes esenciales. Estos son una cámara de vacío, [2] estantes, un condensador de proceso, un sistema de fluido de estante, un sistema de refrigeración, un sistema de vacío y un sistema de control.
La cámara está muy pulida y contiene aislamiento interno. Está fabricado en acero inoxidable y contiene múltiples estantes para sujetar el producto. [ cita necesaria ] Hay un motor hidráulico o eléctrico para garantizar que la puerta esté hermética al vacío cuando esté cerrada.
El condensador de proceso consta de serpentines o placas refrigeradas que pueden ser externas o internas a la cámara. [ cita necesaria ] Durante el proceso de secado, el condensador atrapa agua. Para una mayor eficiencia, la temperatura del condensador debe ser 20 °C (36 °F) menor que la del producto durante el secado primario [ cita necesaria ] y tener un mecanismo de descongelación para garantizar que se condense la cantidad máxima de vapor de agua en el aire.
La cantidad de energía térmica necesaria en los momentos de la fase de secado primaria y secundaria se regula mediante un intercambiador de calor externo. [ cita necesaria ] Por lo general, el aceite de silicona circula por el sistema con una bomba.
Este sistema funciona para enfriar los estantes y el condensador de proceso mediante el uso de compresores o nitrógeno líquido, que suministrará la energía necesaria para que el producto se congele. [ cita necesaria ]
Durante el proceso de secado, el sistema de vacío aplica un vacío de 50 a 100 microbares para eliminar el disolvente. [ cita necesaria ] Se utiliza una bomba de vacío rotativa de dos etapas; sin embargo, si la cámara es grande, se necesitan varias bombas. Este sistema comprime gases no condensables a través del condensador.
Finalmente, el sistema de control establece valores controlados para la temperatura, la presión y el tiempo del estante que dependen del producto y/o del proceso. [35] [36] El liofilizador puede funcionar durante algunas horas o días dependiendo del producto. [ cita necesaria ]
Los liofilizadores de contacto utilizan el contacto (conducción) de los alimentos con el elemento calefactor para suministrar la energía de sublimación. Este tipo de liofilizador es un modelo básico que es fácil de configurar para el análisis de muestras. Una de las principales formas en que los liofilizadores entran en contacto con el calor es mediante plataformas en forma de estante que entran en contacto con las muestras. Los estantes juegan un papel importante ya que se comportan como intercambiadores de calor en diferentes momentos del proceso de liofilización. Están conectados a un sistema de aceite de silicona que eliminará la energía térmica durante la congelación y proporcionará energía durante los tiempos de secado. [ cita necesaria ]
Además, el sistema de fluido de estante funciona para proporcionar temperaturas específicas a los estantes durante el secado bombeando un fluido (generalmente aceite de silicona) a baja presión. La desventaja de este tipo de liofilizador es que el calor solo se transfiere desde el elemento calefactor al lado de la muestra que toca inmediatamente el calentador. Este problema se puede minimizar maximizando el área de superficie de la muestra en contacto con el elemento calefactor mediante el uso de una bandeja acanalada, comprimiendo ligeramente la muestra entre dos placas sólidas calentadas arriba y abajo, o comprimiéndola con una malla calentada desde arriba y desde abajo. [2]
Los liofilizadores radiantes utilizan radiación infrarroja para calentar la muestra en la bandeja. Este tipo de calentamiento permite utilizar bandejas planas simples, ya que se puede ubicar una fuente de infrarrojos encima de las bandejas planas para irradiar hacia abajo sobre el producto. El calentamiento por radiación infrarroja permite un calentamiento uniforme de la superficie del producto, pero tiene poca capacidad de penetración por lo que se utiliza principalmente con bandejas poco profundas y matrices de muestra homogéneas. [2]
Los liofilizadores asistidos por microondas utilizan microondas para permitir una penetración más profunda en la muestra y acelerar los procesos de sublimación y calentamiento en la liofilización. Este método puede resultar complicado de configurar y ejecutar, ya que las microondas pueden crear un campo eléctrico capaz de hacer que los gases de la cámara de muestra se conviertan en plasma. Este plasma podría quemar la muestra, por lo que es imperativo mantener una potencia de microondas adecuada para los niveles de vacío. La tasa de sublimación en un producto puede afectar la impedancia del microondas, por lo que la potencia del microondas debe cambiarse en consecuencia. [2]
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