Los polipéptidos similares a la elastina ( ELP ) son biopolímeros sintéticos con aplicaciones potenciales en los campos de la terapia del cáncer , el andamiaje de tejidos , la recuperación de metales y la purificación de proteínas . Para la terapia contra el cáncer, la adición de grupos funcionales a los ELP puede permitirles conjugarse con fármacos citotóxicos. [1] Además, los ELP pueden funcionar como andamios poliméricos, que promueven la regeneración de tejidos. Esta capacidad de los ELP se ha estudiado particularmente en el contexto del crecimiento óseo. [2] Los ELP también se pueden diseñar para reconocer proteínas específicas en solución. La capacidad de los ELP para sufrir cambios morfológicos a ciertas temperaturas permite separar proteínas específicas que están unidas a los ELP del resto de la solución mediante técnicas experimentales como la centrifugación. [3]
La estructura general de los ELP poliméricos es (VPGXG) n , donde la unidad monomérica es Val - Pro - Gly -X- Gly , y la "X" denota un aminoácido variable que puede tener consecuencias en las propiedades generales del ELP, tales como como temperatura de transición (T t ). Específicamente, la hidrofilicidad o hidrofobicidad y la presencia o ausencia de una carga en el residuo huésped juegan un papel importante en la determinación de la T t. Además, la solubilización del residuo huésped puede afectar la T t. La "n" denota el número de unidades monoméricas que componen el polímero. [4] [5] [6] [7] En general, estos polímeros son lineales por debajo de la T t , pero se agregan en grupos esféricos por encima de la T t. . [3]
Aunque se diseñan y modifican en un laboratorio, los ELP comparten características estructurales con proteínas intrínsecamente desordenadas (IDP) que se encuentran naturalmente en el cuerpo, como la tropoelastina , de la cual los ELP recibieron su nombre. Las secuencias repetidas que se encuentran en el biopolímero le dan a cada ELP una estructura distinta, además de influir en la temperatura crítica más baja de la solución (LCST), también conocida comúnmente como T t . Es a esta temperatura que los ELP pasan de un estado lineal, relativamente desordenado, a un estado parcialmente ordenado y más densamente agregado [7] Aunque se da como una temperatura única, T t, el proceso de cambio de fase de ELP generalmente comienza y termina dentro de una temperatura rango de aproximadamente 2 °C. Además, T t se altera mediante la adición de proteínas únicas a los ELP libres. [5]
La tropoelastina es una proteína, de tamaño 72 kDa, que se une mediante enlaces cruzados para formar elastina en la matriz extracelular de la célula. El proceso de formación de enlaces cruzados está mediado por la lisil oxidasa. [8] Una de las principales razones por las que la elastina puede soportar altos niveles de estrés en el cuerpo sin experimentar ninguna deformación física es que la tropoelastina subyacente contiene dominios que son altamente hidrofóbicos. Estos dominios hidrofóbicos, que consisten abrumadoramente en alanina, prolina, glicina y valina, tienden a la inestabilidad y el desorden, asegurando que la elastina no se bloquee en ninguna confirmación específica. Por lo tanto, los ELP que consisten en unidades monoméricas Val - Pro - Gly -X- Gly , que se parecen a los dominios hidrofóbicos repetitivos de tropoelastina, están muy desordenados por debajo de su T t. Incluso por encima de su T t en su estado agregado, los ELP están sólo parcialmente ordenados. Esto se debe al hecho de que los aminoácidos prolina y glicina están presentes en grandes cantidades en el ELP. La glicina, debido a la falta de una cadena lateral voluminosa, permite que el biopolímero sea flexible y la prolina previene la formación de enlaces de hidrógeno estables en la columna vertebral del ELP. Es importante señalar, sin embargo, que ciertos segmentos del ELP pueden formar giros β instantáneos de tipo II, pero estos giros no son duraderos y no se parecen a las verdaderas láminas β, cuando se comparan los desplazamientos químicos de RMN. [7]
Aunque los ELP generalmente forman agregados esféricos reversibles debido a su contenido de prolina y glicina, existe la posibilidad de que, bajo ciertas condiciones, como temperaturas extremadamente altas, los ELP formen amiloides o agregados irreversibles de proteína insoluble. También se cree que los cambios en la columna vertebral de los ELP que conducen a una reducción en el contenido de prolina y glicina pueden provocar que los ELP sean más propensos al estado amiloide. Como los amiloides están implicados en la progresión de la enfermedad de Alzheimer , así como en enfermedades basadas en priones, como la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (CJD), el modelado de la formación de amiloide ELP puede ser útil desde un punto de vista biomédico. [7]
La temperatura de transición de un ELP depende hasta cierto punto de la identidad del residuo "X" que se encuentra en la cuarta posición de la unidad monomérica pentapeptídica. Los residuos que son altamente hidrófobos, como la leucina y la fenilalanina , tienden a disminuir la temperatura de transición. Por otro lado, los residuos que son altamente hidrófilos, como la serina y la glutamina , tienden a aumentar la temperatura de transición. La presencia de un residuo potencialmente cargado en la posición "X" determinará cómo responde el ELP a diferentes pH, con el ácido glutámico y el ácido aspártico elevando la T t en valores de pH en los que los residuos están desprotonados y la lisina y la arginina elevan la T t. a valores de pH en los que los residuos están protonados. El pH debe ser compatible con los estados cargados de estos aminoácidos para aumentar la Tt . Además, los ELP de masa molecular más alta y las concentraciones más altas de ELP en solución hacen que sea mucho más fácil para el polímero formar agregados, lo que de hecho reduce la T t experimental. [9]
A menudo, las ELP no se utilizan de forma aislada, sino que se fusionan con otras proteínas para volverse funcionalmente activas. La estructura de estas otras proteínas tendrá cierto efecto sobre la temperatura de transición. Es importante poder predecir la temperatura de transición que tendrán estas proteínas de fusión en relación con los ELP libres, ya que esta temperatura determinará la aplicabilidad y la transición de fase de la proteína fusionada . Está disponible un modelo teórico que relaciona el cambio en T t de la proteína fusionada con las proporciones variables de cada aminoácido individual que se encuentra en la proteína fusionada. El modelo implica calcular un índice de superficie (SI) asociado con cada aminoácido y luego extrapolar, basándose en la proporción de cada aminoácido presente en la proteína fusionada, el cambio total en la T t asociada con la proteína de fusión, ΔT t,fusión. : [10]
SI= (ASA XAA / ASA p )(T tc ) [10]
donde ASA p se refiere al área de la proteína fusionada completa que está disponible para el solvente que se está utilizando, ASA XAA se refiere al área del residuo huésped en el ELP que está disponible para el solvente y T tc es la temperatura de transición que es exclusivo del aminoácido. Resumir la contribución de cada residuo huésped potencial (XAA) producirá un índice SI que es directamente proporcional a ΔT t,fusión. Se descubrió que los aminoácidos que se cargan a un pH fisiológico de 7,4 tienen el mayor impacto en el SI general de una proteína fusionada. Esto se debe al hecho de que son más accesibles a los disolventes que contienen agua, aumentando así el ASA XAA y también tienen valores altos de T tc . Por tanto, el conocimiento de la temperatura de transición de una proteína fusionada depende en gran medida de la presencia de estos residuos cargados. [10]
Debido a que los ELP son biopolímeros basados en proteínas, la síntesis implica la manipulación de genes para expresar continuamente la unidad repetitiva monomérica. Se han empleado varias técnicas en la producción de ELP de diversos tamaños, incluida la ligadura unidireccional o concatemerización, la reacción en cadena de la polimerasa de extensión por superposición (OEPCR) y la ligadura direccional recursiva (RDL). [5] [9] Además, los ELP se pueden modificar experimentalmente mediante la conjugación con otros polímeros o mediante la reacción SpyTag/SpyCatcher , [11] permitiendo la síntesis de copolímeros con una morfología única. [12]
El proceso de concatemerización genera bibliotecas de concatámeros para los ELP. Los concatámeros son productos oligoméricos de ligar un solo gen consigo mismo. Esto dará como resultado segmentos repetidos de un gen, todos los cuales pueden transcribirse y traducirse inmediatamente para producir el ELP de interés. Un problema importante con esta ruta sintética es que no se puede controlar el número de segmentos de repetición de genes ligados entre sí para formar el concatámero, lo que da lugar a ELP de diferentes tamaños, de los cuales se debe aislar el ELP de un tamaño deseado. [9]
El método OEPCR utiliza una pequeña cantidad del gen que codifica la unidad ELP monomérica y conduce a la amplificación de este segmento en gran medida. Esta amplificación se debe a que el segmento inicial añadido a la reacción funciona como plantilla, a partir de la cual se pueden sintetizar segmentos genéticos idénticos. El proceso dará como resultado la producción de ADN bicatenario que codifica el ELP de interés. Un obstáculo importante asociado con este método es la fidelidad potencialmente baja asociada con la polimerasa Taq utilizada. Esto podría conducir a la replicación a partir de la plantilla en la que se incorporan nucleótidos incorrectos a la cadena de ADN en crecimiento. [9]
En la ligadura direccional recursiva, el gen que codifica el monómero se inserta en un plásmido con sitios de restricción que son reconocidos por al menos dos endonucleasas . Las endonucleasas cortarán el plásmido y liberarán el gen de interés. Luego, este único gen se inserta en un vector plasmídico receptor que ya contiene una copia del gen del monómero ELP mediante digestión del plásmido receptor con las mismas endonucleasas de restricción utilizadas en el plásmido donante y un paso de ligadura posterior. A partir de este proceso, se recupera una secuencia de dos genes del monómero ELP. RDL permite la síntesis controlada de oligómeros del gen ELP, en los que se añaden secuencialmente segmentos de un solo gen. Sin embargo, las endonucleasas de restricción utilizadas se limitan a aquellas que no cortan dentro del propio gen del monómero ELP, ya que esto conduciría a la pérdida de nucleótidos cruciales y a una posible mutación por desplazamiento del marco de lectura en la proteína. [5]
Los ELP se pueden conjugar sintéticamente con poli ( etilenglicol ) agregando un motivo funcional ciclooctino al poli (etilenglicol) y un grupo azida al ELP. Mediante una reacción de cicloadición que involucra ambos grupos funcionales y la manipulación del pH del solvente, se pueden formar polímeros dibloque y estrella. En lugar de formar los grupos esféricos canónicos por encima de la temperatura de transición, este ELP conjugado específico forma una micela con propiedades anfifílicas , en la que los grupos de cabezas polares miran hacia afuera y los dominios hidrofóbicos miran hacia adentro. Estas micelas pueden resultar útiles para administrar fármacos no polares al organismo. [12]
Debido a la transición de fase única dependiente de la temperatura que experimentan los ELP, en la que pasan de un estado lineal a un estado agregado esférico por encima de su T t , así como a la capacidad de los ELP para conjugarse fácilmente con otros compuestos, estos biopolímeros mantienen numerosos aplicaciones. Algunas de estas aplicaciones implican el uso de ELP en la purificación de proteínas, la terapia contra el cáncer y el andamiaje de tejidos. [1] [2] [3]
El ELP se puede conjugar con un grupo funcional que puede unirse a una proteína de interés. A temperaturas inferiores a T t, el ELP se unirá al ligando en su forma lineal. En este estado lineal, el complejo de proteína ELP no se puede distinguir fácilmente de las proteínas extrañas en la solución. Sin embargo, una vez que la solución se calienta a una temperatura que excede la T t, el ELP formará grumos esféricos. Estos grumos luego se depositarán en el fondo del tubo de solución después de la centrifugación, transportando la proteína de interés. Las proteínas que no sean necesarias se encontrarán en el sobrenadante, que podrá separarse físicamente de los agregados esféricos. Para garantizar que haya pocas impurezas en el complejo de proteína ELP aislado, la solución se puede enfriar por debajo de la T t, lo que permite que los ELP vuelvan a asumir su estructura lineal. A partir de este punto, se pueden repetir los ciclos de centrifugación en caliente y en frío, y luego la proteína de interés se puede eluir de los ELP mediante la adición de una sal. [3]
El comportamiento de fase de los ELP basado en la temperatura se puede utilizar para producir redes rígidas que pueden ser compatibles con aplicaciones de regeneración celular. En concentraciones altas (porcentaje en peso superior al 15%), se detiene la transición ELP de un estado lineal a un estado agregado esférico por encima de la temperatura de transición, lo que conduce a la formación de geles quebradizos. Estas redes, que de otro modo serían frágiles, pueden modificarse químicamente, mediante acoplamiento oxidativo, para producir hidrogeles que puedan soportar altos niveles de tensión y tensión mecánica. Además, las redes de gel modificadas contienen poros, a través de los cuales se pueden administrar fácilmente importantes compuestos sustentadores de células. Se ha descubierto que estos hidrogeles fuertes, cuando se bañan en un medio celular mínimo, promueven el crecimiento de poblaciones de células madre mesenciales humanas. La capacidad de estas redes ELP detenidas para promover el crecimiento celular puede resultar indispensable en la producción de estructuras tisulares que promuevan la producción de cartílago, por ejemplo. Una intervención de este tipo puede resultar útil en el tratamiento de enfermedades óseas y artritis reumatoide . [2]
Los ELP modificados con ciertos grupos funcionales tienen la capacidad de conjugarse con fármacos, incluidos agentes quimioterapéuticos . [13] Juntos, el complejo ELP-fármaco puede ser absorbido en mayor medida por las células tumorales, promoviendo la actividad citotóxica del fármaco. La razón por la que los complejos se dirigen preferentemente a las células tumorales es que estas células tienden a asociarse con vasos sanguíneos más permeables y también poseen una presencia linfática más débil. Básicamente, esto significa que los fármacos pueden pasar de los vasos a las células tumorales con mayor frecuencia y pueden permanecer en los vasos durante más tiempo sin ser filtrados. La transición de fase asociada con los ELP también se puede utilizar para promover la absorción del fármaco por parte de las células tumorales. Al calentar localmente las regiones de células tumorales, el complejo ELP-fármaco se agregará en grupos esféricos. Si este complejo ELP-fármaco está diseñado para exponer dominios funcionales en forma de grupo esférico que son reconocidos por las superficies de las células tumorales, entonces esta interacción en la superficie celular promovería la absorción del fármaco, ya que la célula tumoral confundiría el complejo ELP-fármaco como si fuera un sustancia inofensiva. [1] [9]
Un estudio reciente destaca el primer informe sobre la proteína selectiva de elementos de tierras raras (REE) termosensible . El ELP y el dominio de unión a REE se fusionan genéticamente para formar ELP codificado genéticamente termosensible y selectivo para REE llamado RELP para la extracción selectiva y la recuperación de REE totales. RELP muestra una plataforma de biosorción selectiva y repetible para la recuperación de REE. Los autores destacaron que la tecnología se puede adaptar para recuperar otros metales y materias primas preciosas . [14]
