En química orgánica , la síntesis de péptidos es la producción de péptidos , compuestos donde se unen múltiples aminoácidos mediante enlaces amida, también conocidos como enlaces peptídicos . Los péptidos se sintetizan químicamente mediante la reacción de condensación del grupo carboxilo de un aminoácido al grupo amino de otro. Generalmente son necesarias estrategias de grupos protectores para prevenir reacciones secundarias indeseables con las diversas cadenas laterales de aminoácidos. [1] La síntesis química de péptidos comúnmente comienza en el extremo carboxilo del péptido (terminal C) y continúa hacia el extremo amino ( terminal N ). [2] La biosíntesis de proteínas (péptidos largos) en los organismos vivos se produce en la dirección opuesta.
La síntesis química de péptidos se puede llevar a cabo utilizando técnicas clásicas en fase de solución, aunque éstas han sido reemplazadas en la mayoría de los entornos de investigación y desarrollo por métodos de fase sólida (ver más abajo). [3] Además, la síntesis en fase de solución conserva su utilidad en la producción a gran escala de péptidos con fines industriales.
La síntesis química facilita la producción de péptidos que son difíciles de expresar en bacterias, la incorporación de aminoácidos no naturales, la modificación del esqueleto peptídico/proteico y la síntesis de proteínas D, que consisten en D-aminoácidos .
El método establecido para la producción de péptidos sintéticos en el laboratorio se conoce como síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS). [2] Iniciado por Robert Bruce Merrifield , [4] [5] SPPS permite el ensamblaje rápido de una cadena peptídica a través de reacciones sucesivas de derivados de aminoácidos sobre un soporte de resina microscópica hinchada con disolvente macroscópicamente insoluble. [ cita necesaria ]
El soporte sólido consta de pequeñas perlas de resina polimérica funcionalizadas con grupos reactivos (como grupos amina o hidroxilo) que se unen a la cadena peptídica naciente. [2] Dado que el péptido permanece unido covalentemente al soporte durante toda la síntesis, el exceso de reactivos y productos secundarios se pueden eliminar mediante lavado y filtración. Este enfoque evita el aislamiento comparativamente lento del péptido producto de la solución después de cada paso de reacción, que sería necesario cuando se utiliza la síntesis convencional en fase de solución. [ cita necesaria ]
Cada aminoácido que se va a acoplar al extremo N de la cadena peptídica debe protegerse en su extremo N y en su cadena lateral utilizando grupos protectores apropiados como Boc (lábil en ácido) o Fmoc (lábil en base), dependiendo de la cadena lateral y la estrategia de protección utilizada (ver más abajo). [1]
El procedimiento general de SPPS es uno de ciclos repetidos de reacciones alternas de desprotección y acoplamiento del N-terminal. La resina se puede lavar entre cada paso. [2] Primero se acopla un aminoácido a la resina. Posteriormente, la amina se desprotege y luego se acopla con el grupo carboxilo activado del siguiente aminoácido que se agregará. Este ciclo se repite hasta que se haya sintetizado la secuencia deseada. Los ciclos SPPS también pueden incluir pasos de protección que bloquean la reacción de los extremos de los aminoácidos que no han reaccionado. Al final de la síntesis, el péptido crudo se escinde del soporte sólido y al mismo tiempo se eliminan todos los grupos protectores utilizando un reactivo como el ácido trifluoroacético. [2] El péptido crudo se puede precipitar en un disolvente no polar como el éter dietílico para eliminar los subproductos orgánicos solubles. El péptido crudo se puede purificar usando HPLC de fase reversa . [6] [7] El proceso de purificación, especialmente de péptidos más largos, puede ser un desafío, porque deben eliminarse cantidades acumuladas de numerosos subproductos menores, que tienen propiedades similares al producto peptídico deseado. Por este motivo, los procesos denominados de cromatografía continua, como MCSGP , se utilizan cada vez más en entornos comerciales para maximizar el rendimiento sin sacrificar la pureza. [8]
SPPS está limitado por los rendimientos de la reacción debido a la acumulación exponencial de subproductos y, por lo general, los péptidos y proteínas en el rango de 70 aminoácidos están superando los límites de la accesibilidad sintética. [2] La dificultad sintética también depende de la secuencia; Por lo general, las secuencias propensas a la agregación, como las amiloides [9], son difíciles de crear. Se puede acceder a longitudes más largas mediante el uso de enfoques de ligación, como la ligación química nativa , donde se pueden unir en solución dos péptidos sintéticos más cortos y completamente desprotegidos.
Una característica importante que ha permitido la amplia aplicación de SPPS es la generación de rendimientos extremadamente altos en la etapa de acoplamiento. [2] Se requieren condiciones de formación de enlaces amida altamente eficientes . Para ilustrar el impacto de los rendimientos de acoplamiento subóptimos para una síntesis determinada, considere el caso en el que cada paso de acoplamiento tuviera al menos un rendimiento del 99 %: esto daría como resultado un rendimiento bruto total del 77 % para un péptido de 26 aminoácidos (asumiendo 100 % rendimiento en cada desprotección); Si cada acoplamiento tuviera una eficiencia del 95%, el rendimiento general sería del 25%. [10] [11] y añadiendo un exceso de cada aminoácido (entre 2 y 10 veces). La minimización de la racemización de aminoácidos durante el acoplamiento también es de vital importancia para evitar la epimerización en el producto peptídico final. [ cita necesaria ]
La formación de enlaces amida entre una amina y un ácido carboxílico es lenta y, como tal, normalmente requiere "reactivos de acoplamiento" o "activadores". Existe una amplia gama de reactivos de acoplamiento, debido en parte a su eficacia variable para acoplamientos particulares; [12] [13] muchos de estos reactivos están disponibles comercialmente.
Las carbodiimidas como la diciclohexilcarbodiimida (DCC) y la diisopropilcarbodiimida (DIC) se utilizan con frecuencia para la formación de enlaces amida. [11] La reacción se desarrolla mediante la formación de una O - acilisourea altamente reactiva . Este intermedio reactivo es atacado por la amina N-terminal del péptido, formando un enlace peptídico. La formación de O -acilisourea se produce más rápidamente en disolventes apolares como el diclorometano. [14]
La DIC es particularmente útil para SPPS ya que, como líquido, se dispensa fácilmente y el subproducto de urea se elimina fácilmente por lavado. Por el contrario, la carbodiimida relacionada 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) se usa a menudo para acoplamientos de péptidos en fase de solución, ya que su subproducto de urea se puede eliminar mediante lavado durante el tratamiento acuoso . [11]
La activación de carbodiimida abre la posibilidad de racemización del aminoácido activado. [11] La racemización se puede evitar con aditivos 'supresores de la racemización' como los triazoles 1-hidroxibenzotriazol (HOBt) y 1-hidroxi-7-aza-benzotriazol (HOAt). Estos reactivos atacan el intermedio O -acilisourea para formar un éster activo , que posteriormente reacciona con el péptido para formar el enlace peptídico deseado. [15] El cianohidroxiiminoacetato de etilo (Oxyma), un aditivo para el acoplamiento de carbodiimida, actúa como una alternativa al HOAt. [dieciséis]
Algunos reactivos de acoplamiento omiten la carbodiimida por completo e incorporan el resto HOAt/HOBt como una sal de amonio/uronio o fosfonio de un anión no nucleofílico ( tetrafluoroborato o hexafluorofosfato ). [10] Ejemplos de reactivos de amonio/uronio incluyen HATU (HOAt), HBTU / TBTU (HOBt) y HCTU (6-ClHOBt). HBTU y TBTU se diferencian únicamente en la elección del anión. Los reactivos de fosfonio incluyen PyBOP (HOBt) y PyAOP (HOAt). [ cita necesaria ]
Estos reactivos forman las mismas especies de éster activo que las condiciones de activación de carbodiimida, pero difieren en la velocidad del paso de activación inicial, que está determinada por la naturaleza del esqueleto de carbono del reactivo de acoplamiento. [17] Además, los reactivos de amonio/uronio son capaces de reaccionar con el extremo N del péptido para formar un subproducto de guanidino inactivo, mientras que los reactivos de fosfonio no lo son.
Desde finales de la década de 2000, el anhídrido del ácido propanofosfónico , vendido comercialmente con varios nombres como "T3P", se ha convertido en un reactivo útil para la formación de enlaces amida en aplicaciones comerciales. Convierte el oxígeno del ácido carboxílico en un grupo saliente, cuyos subproductos de acoplamiento peptídico son solubles en agua y pueden eliminarse fácilmente por lavado. En una comparación de rendimiento entre el anhídrido de ácido propanofosfónico y otros reactivos de acoplamiento de péptidos para la preparación de un fármaco no peptídico, se encontró que este reactivo era superior a otros reactivos con respecto al rendimiento y la baja epimerización. [18]
Los soportes sólidos para la síntesis de péptidos se seleccionan por su estabilidad física, para permitir la filtración rápida de líquidos. Los soportes adecuados son inertes a los reactivos y disolventes utilizados durante el SPPS y permiten la unión del primer aminoácido. [19] La hinchazón es de gran importancia porque la síntesis de péptidos tiene lugar dentro de los poros hinchados del soporte sólido. [20]
Los tres tipos principales de soportes sólidos son: soportes tipo gel, soportes tipo superficie y compuestos. [19] Las mejoras en los soportes sólidos utilizados para la síntesis de péptidos mejoran su capacidad para resistir el uso repetido de TFA durante el paso de desprotección de SPPS. [21] Se utilizan dos resinas primarias, en función de si se desea un ácido carboxílico C-terminal o una amida. La resina Wang era, en 1996 [actualizar], la resina más utilizada para péptidos con ácidos carboxílicos C-terminales. [22] [ necesita actualización ]
Como se describió anteriormente, el uso de grupos protectores de cadena lateral y N-terminal es esencial durante la síntesis de péptidos para evitar reacciones secundarias indeseables, como el autoacoplamiento del aminoácido activado que conduce a ( polimerización ). [1] Esto competiría con la reacción de acoplamiento de péptidos prevista, lo que daría como resultado un bajo rendimiento o incluso una falla total en la síntesis del péptido deseado. [ cita necesaria ]
En la síntesis de péptidos en fase sólida se utilizan normalmente dos esquemas principales de grupos protectores: los llamados enfoques Boc/bencilo y Fmoc/ terc- butilo. [2] La estrategia Boc/Bzl utiliza protección Boc N-terminal lábil a TFA junto con protección de cadena lateral que se elimina usando fluoruro de hidrógeno anhidro durante el paso de escisión final (con escisión simultánea del péptido del soporte sólido). Fmoc/tBu SPPS utiliza protección Fmoc N-terminal lábil a las bases , con protección de cadena lateral y un enlace de resina que son lábiles a los ácidos (la escisión ácida final se lleva a cabo mediante tratamiento con TFA).
Ambos enfoques, incluidas las ventajas y desventajas de cada uno, se describen con más detalle a continuación.
Antes de la llegada de SPPS, los métodos de solución para la síntesis química de péptidos se basaban en el terc -butiloxicarbonilo (abreviado 'Boc') como grupo protector α-amino N-terminal temporal. El grupo Boc se elimina con un ácido, como el ácido trifluoroacético (TFA). Esto forma un grupo amino cargado positivamente en presencia de exceso de TFA (tenga en cuenta que el grupo amino no está protonado en la imagen de la derecha), que se neutraliza y se acopla al aminoácido activado entrante. [23] La neutralización puede ocurrir antes del acoplamiento o in situ durante la reacción de acoplamiento básica.
El enfoque Boc/Bzl conserva su utilidad para reducir la agregación de péptidos durante la síntesis. [24] Además, se puede preferir Boc/bencil SPPS al enfoque Fmoc/ terc- butilo cuando se sintetizan péptidos que contienen restos sensibles a bases (como depsipéptidos o restos tioéster), ya que se requiere tratamiento con base durante el paso de desprotección de Fmoc ( vea abajo).
Los grupos protectores permanentes de cadena lateral usados durante Boc/bencil SPPS son típicamente grupos bencilo o grupos basados en bencilo. [1] La eliminación final del péptido del soporte sólido se produce simultáneamente con la desprotección de la cadena lateral utilizando fluoruro de hidrógeno anhidro mediante escisión hidrolítica. El producto final es una sal de fluoruro que es relativamente fácil de solubilizar. Se deben agregar eliminadores como cresol al HF para evitar que los cationes reactivos generen subproductos no deseados.
El uso de protección Fmoc N-terminal permite un esquema de desprotección más suave que el usado para Boc/Bzl SPPS, y este esquema de protección es verdaderamente ortogonal en condiciones de SPPS. [26] La desprotección de Fmoc utiliza una base, típicamente 20-50% de piperidina en DMF . [19] La amina expuesta es, por lo tanto, neutra y, en consecuencia, no se requiere neutralización del péptido-resina, como en el caso del enfoque Boc/Bzl. Sin embargo , la falta de repulsión electrostática entre las cadenas peptídicas puede aumentar el riesgo de agregación con Fmoc/ t Bu SPPS. Debido a que el grupo fluorenilo liberado es un cromóforo, la desprotección de Fmoc puede controlarse mediante la absorbancia UV de la mezcla de reacción, una estrategia que se emplea en sintetizadores de péptidos automatizados.
La capacidad del grupo Fmoc para escindirse en condiciones básicas relativamente suaves y al mismo tiempo ser estable al ácido permite el uso de grupos protectores de cadena lateral como Boc y t Bu que pueden eliminarse en condiciones ácidas de escisión final (TFA) más suaves que las utilizadas para escisión final en Boc/Bzl SPPS (HF). Los eliminadores como agua y triisopropilsilano (TIPS) se añaden más comúnmente durante la escisión final para evitar reacciones secundarias con especies catiónicas reactivas liberadas como resultado de la desprotección de la cadena lateral. Sin embargo, también podrían usarse muchos otros compuestos eliminadores. [27] [28] [29] El péptido crudo resultante se obtiene como una sal de TFA, que es potencialmente más difícil de solubilizar que las sales de fluoruro generadas en Boc SPPS.
Fmoc/ t Bu SPPS es menos económico desde el punto de vista atómico , ya que el grupo fluorenilo es mucho más grande que el grupo Boc. En consecuencia, los precios de los aminoácidos Fmoc fueron altos hasta que en la década de 1990 comenzó la prueba piloto a gran escala de uno de los primeros fármacos peptídicos sintetizados, la enfuvirtida , cuando la demanda del mercado ajustó los precios relativos de los aminoácidos Fmoc- frente a los Boc-.
El grupo (Z) es otro grupo protector de amina de tipo carbamato, descubierto por Leonidas Zervas a principios de la década de 1930 y generalmente agregado mediante reacción con cloroformiato de bencilo . [30]
Se elimina en condiciones duras utilizando HBr en ácido acético o condiciones más suaves de hidrogenación catalítica .
Esta metodología fue utilizada por primera vez en la síntesis de oligopéptidos por Zervas y Max Bergmann en 1932. [31] Por lo tanto, esto se conoció como la síntesis de Bergmann-Zervas, que se caracterizó por "hacer época" y ayudó a establecer la química de los péptidos sintéticos como una campo. [30] Constituyó el primer método de laboratorio útil para la síntesis controlada de péptidos, permitiendo la síntesis de péptidos previamente inalcanzables con cadenas laterales reactivas, mientras que también se evita que los aminoácidos protegidos con Z se sometan a racemización . [30] [31]
El uso del método Bergmann-Zervas siguió siendo la práctica estándar en la química de péptidos durante dos décadas después de su publicación, reemplazado por métodos más nuevos (como el grupo protector Boc) a principios de la década de 1950. [30] Hoy en día, si bien se ha utilizado periódicamente para la protección de α-aminas, se utiliza mucho más comúnmente para la protección de cadenas laterales.
El grupo protector aliloxicarbonilo (alloc) se utiliza a veces para proteger un grupo amino (o un grupo de ácido carboxílico o alcohol) cuando se requiere un esquema de desprotección ortogonal. A veces también se utiliza cuando se lleva a cabo la formación de péptidos cíclicos sobre resina, donde el péptido está unido a la resina mediante un grupo funcional de cadena lateral. El grupo Alloc se puede eliminar usando tetraquis (trifenilfosfina) paladio (0) . [32]
Para aplicaciones especiales, como pasos sintéticos que involucran micromatrices de proteínas , se utilizan grupos protectores a veces denominados "litográficos", que son susceptibles a la fotoquímica en una longitud de onda de luz particular y, por lo tanto, pueden eliminarse durante tipos de operaciones litográficas . [33] [34] [35] [36]
La formación de múltiples disulfuros nativos sigue siendo un desafío para la síntesis de péptidos nativos mediante métodos en fase sólida. La combinación aleatoria de cadenas normalmente da como resultado varios productos con enlaces disulfuro no nativos. [37] La formación gradual de enlaces disulfuro suele ser el método preferido y se realiza con grupos protectores tiol. [38] Los diferentes grupos protectores de tiol proporcionan múltiples dimensiones de protección ortogonal. Estas cisteínas protegidas ortogonalmente se incorporan durante la síntesis en fase sólida del péptido. La eliminación sucesiva de estos grupos, para permitir la exposición selectiva de los grupos tiol libres, conduce a la formación de disulfuro de manera gradual. Se debe considerar el orden de eliminación de los grupos de manera que solo se elimine un grupo a la vez.
Los grupos protectores de tiol utilizados en la síntesis de péptidos que requieren la formación posterior de enlaces disulfuro regioselectivos deben poseer múltiples características. [39] [40] En primer lugar, deben ser reversibles con condiciones que no afecten a las cadenas laterales desprotegidas. En segundo lugar, el grupo protector debe poder resistir las condiciones de la síntesis en fase sólida. En tercer lugar, la eliminación del grupo protector tiol debe ser tal que deje intactos otros grupos protectores tiol, si se desea una protección ortogonal. Es decir, la eliminación de PG A no debería afectar a PG B. Algunos de los grupos protectores de tiol comúnmente utilizados incluyen acetamidometilo (Acm), terc -butilo (But), 3-nitro-2-piridinsulfenilo (NPYS), 2- Grupos piridina-sulfenilo (Pyr) y tritilo (Trt). [39] Es importante destacar que el grupo NPYS puede reemplazar el Acm PG para producir un tiol activado. [41]
Utilizando este método, Kiso y sus compañeros informaron de la primera síntesis total de insulina en 1993. [42] En este trabajo, la cadena A de la insulina se preparó con los siguientes grupos protectores en sus cisteínas: CysA6(But), CysA7(Acm ), y CysA11(But), dejando a CysA20 desprotegida. [42]
La síntesis de péptidos asistida por microondas se ha utilizado para completar secuencias peptídicas largas con altos grados de rendimiento y bajos grados de racemización. [43] [44]
El primer artículo relacionado con la síntesis de péptidos de flujo continuo se publicó en 1986, [45] pero debido a limitaciones técnicas, no fue hasta principios de la década de 2010 cuando más grupos académicos comenzaron a utilizar el flujo continuo para la síntesis rápida de péptidos. [46] [47] Las ventajas del flujo continuo sobre los métodos por lotes tradicionales es la capacidad de calentar reactivos con un buen control de temperatura, lo que permite la velocidad de la cinética de reacción y al mismo tiempo minimiza las reacciones secundarias. [48] los tiempos de los ciclos varían desde 30 segundos hasta 6 minutos, dependiendo de las condiciones de reacción y el exceso de reactivo.
Gracias a los análisis en línea, como la espectroscopia UV/Vis y el uso de un reactor de flujo de lecho variable (VBFR) que monitorea el volumen de resina, se puede identificar la agregación en la resina y se puede evaluar la eficiencia del acoplamiento. [49]
El alargamiento gradual, en el que los aminoácidos se conectan paso a paso, es ideal para péptidos pequeños que contienen entre 2 y 100 residuos de aminoácidos. Otro método es la condensación de fragmentos , en la que se acoplan fragmentos de péptidos. [50] [51] [52] Aunque el primero puede alargar la cadena peptídica sin racemización , el rendimiento cae si solo se usa en la creación de péptidos largos o altamente polares. La condensación de fragmentos es mejor que la elongación gradual para sintetizar péptidos largos sofisticados, pero su uso debe restringirse para proteger contra la racemización. La condensación de fragmentos también es indeseable ya que el fragmento acoplado debe estar en exceso, lo que puede ser una limitación dependiendo de la longitud del fragmento. [53]
Un nuevo desarrollo para producir cadenas peptídicas más largas es la ligadura química : las cadenas peptídicas desprotegidas reaccionan quimioselectivamente en solución acuosa. Un primer producto controlado cinéticamente se reordena para formar el enlace amida. La forma más común de ligación química nativa utiliza un tioéster peptídico que reacciona con un residuo de cisteína terminal. [54]
Otros métodos aplicables para unir covalentemente polipéptidos en solución acuosa incluyen el uso de inteínas divididas , [55] formación espontánea de enlaces isopeptídicos [56] y ligadura con sortasa . [57]
Para optimizar la síntesis de péptidos largos , en Medicon Valley se desarrolló un método para convertir secuencias de péptidos . [ cita necesaria ] La presecuencia simple (p. ej., lisina (Lysn); ácido glutámico (Glun); (LysGlu)n) que se incorpora en el extremo C del péptido para inducir una estructura similar a una hélice alfa . Esto puede potencialmente aumentar la vida media biológica , mejorar la estabilidad de los péptidos e inhibir la degradación enzimática sin alterar la actividad farmacológica o el perfil de acción. [58] [59]
Los péptidos se pueden ciclar sobre un soporte sólido. Se puede utilizar una variedad de reactivos de ciclación, como HBTU/HOBt/DIEA, PyBop/DIEA, PyClock/DIEA. [60] Se pueden preparar péptidos de cabeza a cola sobre el soporte sólido. La desprotección del extremo C en algún punto adecuado permite la ciclación en la resina mediante la formación de enlaces amida con el extremo N desprotegido. Una vez que ha tenido lugar la ciclación, el péptido se escinde de la resina mediante acidólisis y se purifica. [61] [62]
La estrategia para la síntesis en fase sólida de péptidos cíclicos no se limita a la unión a través de cadenas laterales de Asp, Glu o Lys. La cisteína tiene un grupo sulfhidrilo muy reactivo en su cadena lateral. Un puente disulfuro se crea cuando un átomo de azufre de una cisteína forma un enlace covalente único con otro átomo de azufre de una segunda cisteína en una parte diferente de la proteína. Estos puentes ayudan a estabilizar las proteínas, especialmente las secretadas por las células. Algunos investigadores utilizan cisteínas modificadas utilizando S-acetomidometilo (Acm) para bloquear la formación del enlace disulfuro pero preservar la cisteína y la estructura primaria original de la proteína. [63]
La ciclación fuera de resina es una síntesis en fase sólida de intermediarios clave, seguida de la ciclación clave en fase de solución; la desprotección final de cualquier cadena lateral enmascarada también se lleva a cabo en fase de solución. Esto tiene las desventajas de que las eficiencias de la síntesis en fase sólida se pierden en las etapas de la fase de solución, que se requiere la purificación de subproductos, reactivos y material no convertido, y que se pueden formar oligómeros no deseados si está involucrada la formación de macrociclos . [64]
El uso de ésteres de pentafluorofenilo (FDPP, [65] PFPOH [66] ) y BOP-Cl [67] son útiles para ciclar péptidos.
El primer péptido protegido fue sintetizado por Theodor Curtius en 1882 y el primer péptido libre fue sintetizado por Emil Fischer en 1901. [3]