La ligadura química nativa (NCL) es una extensión importante del concepto de ligadura química para construir una cadena polipeptídica más grande mediante la condensación covalente de dos o más segmentos peptídicos desprotegidos. [1] La ligadura química nativa es el método más eficaz para sintetizar proteínas nativas o modificadas de tamaño típico ( es decir , proteínas <~300 AA). [2]
En la ligación química nativa, el grupo tiol ionizado de un residuo de cisteína N-terminal de un péptido desprotegido ataca al tioéster C-terminal de un segundo péptido desprotegido, en un tampón acuoso a pH 7,0 y temperatura ambiente. Este paso de transtioesterificación es reversible en presencia de un catalizador de aril tiol, lo que hace que la reacción sea tanto quimioselectiva como regioselectiva, y conduce a la formación de un intermedio unido a un tioéster. El intermedio se reorganiza rápida y espontáneamente mediante un desplazamiento S,N-acilo intramolecular que da como resultado la formación de un enlace amida nativo (' péptido ') en el sitio de ligación (esquema 1).
Observaciones:
El paso inicial de transtioesterificación de la reacción de ligación química nativa está catalizado por aditivos de tiol. El catalizador de tiol más eficaz y comúnmente utilizado es el ácido 4-mercaptofenilacético (MPAA), (ref).
La característica clave de la ligadura química nativa de péptidos no protegidos es la reversibilidad del primer paso , la reacción de intercambio de tiol(ato)-tioéster. La ligadura química nativa es exquisitamente regioselectiva porque ese paso de intercambio de tiol(ato)-tioéster es libremente reversible en presencia de un catalizador de ariltiol añadido. Los altos rendimientos del producto de ligadura final obtenido, incluso en presencia de residuos de Cys internos en uno o ambos segmentos, son el resultado de la irreversibilidad del segundo paso de formación de amida (desplazamiento de acilo S a N) en las condiciones de reacción utilizadas.
No se forman productos secundarios de la reacción con los otros grupos funcionales presentes en cualquiera de los segmentos peptídicos (por ejemplo, Asp, ácidos carboxílicos de cadena lateral Glu; grupo amino épsilon de Lys; hidroxilo fenólico de Tyr; hidroxilos de Ser, Thr, etc.).
En 1992, Stephen Kent y Martina Schnölzer, del Instituto de Investigación Scripps, desarrollaron el concepto de "ligación química", el primer método práctico para condensar covalentemente segmentos peptídicos desprotegidos; la característica clave de la ligación química es la formación de un enlace no natural en el sitio de ligación. Apenas dos años después, en 1994, Philip Dawson, Tom Muir y Stephen Kent informaron sobre la "ligación química nativa", una extensión del concepto de ligación química a la formación de un enlace amida nativo ("péptido") después de que la condensación nucleofílica inicial formara un producto de condensación unido por tioéster diseñado para reorganizarse espontáneamente en el enlace amida nativo en el sitio de ligación.
Theodor Wieland y sus colaboradores habían informado sobre el cambio de acilo de S a N en 1953, cuando se demostró que la reacción del tioéster de valina y el aminoácido cisteína en un tampón acuoso producía el dipéptido valina-cisteína. [3] La reacción se producía a través de la intermediación de un tioéster que contenía el azufre del residuo de cisteína. Sin embargo, el trabajo de Wieland NO condujo al desarrollo de la reacción de ligación química nativa. Más bien, el estudio de las reacciones del tioéster de aminoácidos llevó a Wieland y a otros a desarrollar el método del "éster activo" para la síntesis de segmentos peptídicos protegidos mediante métodos químicos convencionales realizados en disolventes orgánicos.
La ligación química nativa constituye la base de la síntesis química de proteínas moderna y se ha utilizado para preparar numerosas proteínas y enzimas mediante síntesis química total. La ventaja del método de ligación química nativa es que el acoplamiento de péptidos largos mediante esta técnica suele ser casi cuantitativo y proporciona acceso sintético a péptidos y proteínas grandes que de otro modo serían imposibles de producir debido a su gran tamaño, a su decoración mediante modificación postraduccional y a que contienen aminoácidos no codificados u otros bloques químicos básicos.
La ligación química nativa es inherentemente "ecológica" en su economía de átomos y en el uso de solventes benignos. Implica la reacción de un tioéster peptídico desprotegido con un segundo péptido desprotegido que tiene un residuo de cisteína N-terminal. Se lleva a cabo en solución acuosa a pH neutro, generalmente en clorhidrato de guanidina 6 M, en presencia de un catalizador de ariltiol y, por lo general, produce rendimientos casi cuantitativos del producto de ligación deseado.
Los tioésteres de péptidos se pueden preparar directamente mediante química Boc SPPS ; sin embargo, los péptidos que contienen tioésteres no son estables al tratamiento con una base nucleófila, lo que impide la síntesis directa de tioésteres de péptidos mediante química Fmoc SPPS . Las técnicas de síntesis de péptidos en fase sólida de química Fmoc para generar tioésteres de péptidos se basan en la síntesis de hidrazidas de péptidos que se convierten en tioésteres de péptidos de manera postsintética.
Los tioésteres C-terminales de polipéptidos también se pueden producir in situ , utilizando los llamados sistemas de desplazamiento N,S -acilo. El grupo bis (2-sulfaniletil)amido, también llamado grupo SEA, pertenece a esta familia. Las bis (2-sulfaniletil)amidas C-terminales de polipéptidos (segmentos peptídicos SEA) reaccionan con el péptido Cys para dar un enlace peptídico nativo como en NCL. Esta reacción, que se llama ligadura de péptidos nativos SEA , es una variante útil de la ligadura química nativa. [4]
Al preparar segmentos peptídicos que contienen un residuo de cisteína N-terminal, se debe evitar la exposición a cetonas, ya que estas pueden tapar la cisteína N-terminal. No utilice grupos protectores que liberen aldehídos o cetonas . Por la misma razón, se debe evitar el uso de acetona , en particular al lavar el material de vidrio utilizado para la liofilización .
Una característica de la técnica de ligadura química nativa es que la cadena polipeptídica del producto contiene cisteína en el sitio de ligadura. La cisteína en el sitio de ligadura se puede desulfurar a alanina , ampliando así el rango de posibles sitios de ligadura para incluir residuos de alanina. Se pueden utilizar otros aminoácidos que contengan beta-tiol para la ligadura química nativa, seguida de desulfuración. Alternativamente, se pueden utilizar auxiliares de ligadura que contengan tiol que imiten una cisteína N-terminal para la reacción de ligadura, pero que se puedan eliminar después de la síntesis. El uso de auxiliares que contengan tiol puede no ser tan efectivo como la ligadura en un residuo de Cys. La ligadura química nativa también se puede realizar con un residuo de selenocisteína N-terminal. [5]
Los tioésteres polipeptídicos C-terminales producidos mediante técnicas de ADN recombinante pueden reaccionar con un polipéptido que contiene Cys N-terminal mediante la misma química de ligadura nativa para proporcionar proteínas semisintéticas muy grandes. La ligadura química nativa de este tipo que utiliza un segmento polipeptídico recombinante se conoce como ligadura de proteína expresada. De manera similar, una proteína recombinante que contiene una Cys N-terminal puede reaccionar con un tioéster polipeptídico sintético . Por lo tanto, la ligadura química nativa puede utilizarse para introducir segmentos sintetizados químicamente en proteínas recombinantes, independientemente del tamaño.
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