En bioquímica , una nucleasa (también conocida arcaicamente como nucleodespolimerasa o polinucleotidasa ) es una enzima capaz de escindir los enlaces fosfodiéster entre nucleótidos de ácidos nucleicos . Las nucleasas provocan de diversas formas roturas monocatenarias y bicatenarias en sus moléculas diana. En los organismos vivos, son maquinaria esencial para muchos aspectos de la reparación del ADN . Los defectos en ciertas nucleasas pueden causar inestabilidad genética o inmunodeficiencia . [1] Las nucleasas también se utilizan ampliamente en la clonación molecular . [2]
Hay dos clasificaciones principales basadas en el lugar de actividad. Las exonucleasas digieren los ácidos nucleicos desde los extremos. Las endonucleasas actúan en regiones intermedias de las moléculas diana. Además, se subclasifican en desoxirribonucleasas y ribonucleasas . El primero actúa sobre el ADN , el segundo sobre el ARN . [2]
A finales de la década de 1960, los científicos Stuart Linn y Werner Arber aislaron ejemplos de los dos tipos de enzimas responsables de la restricción del crecimiento de fagos en la bacteria Escherichia coli ( E. coli ). [3] [4] Una de estas enzimas añadió un grupo metilo al ADN, generando ADN metilado , mientras que la otra escindió el ADN no metilado en una amplia variedad de ubicaciones a lo largo de la molécula. El primer tipo de enzima se denominó " metilasa " y el otro " nucleasa de restricción ". Estas herramientas enzimáticas eran importantes para los científicos que estaban reuniendo las herramientas necesarias para " cortar y pegar " moléculas de ADN. Lo que entonces se necesitaba era una herramienta que cortara el ADN en sitios específicos, en lugar de en sitios aleatorios a lo largo de la molécula, de modo que los científicos pudieran cortar las moléculas de ADN de una manera predecible y reproducible.
Se produjo un avance importante cuando HO Smith , KW Wilcox y TJ Kelly , trabajando en la Universidad Johns Hopkins en 1968, aislaron y caracterizaron la primera nucleasa de restricción cuyo funcionamiento dependía de una secuencia de nucleótidos de ADN específica . Trabajando con la bacteria Haemophilus influenzae , este grupo aisló una enzima, llamada HindII, que siempre corta las moléculas de ADN en un punto particular dentro de una secuencia específica de seis pares de bases. Descubrieron que la enzima Hind II siempre corta directamente en el centro de esta secuencia (entre el tercer y cuarto par de bases).
La mayoría de las nucleasas están clasificadas por el número de la Comisión de Enzimas del "Comité de Nomenclatura de la Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular " como hidrolasas (número CE 3). Las nucleasas pertenecen, al igual que la fosfodiesterasa , la lipasa y la fosfatasa, a las esterasas (número CE 3.1), un subgrupo de las hidrolasas. Las esterasas a las que pertenecen las nucleasas están clasificadas con los números CE 3.1.11 - número CE 3.1.31.
La estructura primaria de la nucleasa está en general poco conservada y mínimamente conservada en los sitios activos, cuyas superficies comprenden principalmente residuos de aminoácidos ácidos y básicos. Las nucleasas se pueden clasificar en familias de plegamiento. [5]
Una nucleasa debe asociarse con un ácido nucleico antes de poder escindir la molécula. Eso implica cierto grado de reconocimiento. Las nucleasas emplean de diversas formas asociaciones específicas y no específicas en sus modos de reconocimiento y unión. Ambos modos desempeñan funciones importantes en los organismos vivos, especialmente en la reparación del ADN. [7]
Las endonucleasas no específicas implicadas en la reparación del ADN pueden escanear el ADN en busca de secuencias diana o daños . Una nucleasa de este tipo se difunde a lo largo del ADN hasta que encuentra un objetivo, en el que los residuos de su sitio activo interactúan con los grupos químicos del ADN. En el caso de endonucleasas como EcoRV , BamHI y PvuII, esta unión no específica implica interacciones electrostáticas entre una superficie mínima de la proteína y el ADN. Esta asociación débil deja la forma general del ADN sin deformar, permaneciendo en forma B. [7]
APor el contrario , la nucleasa específica de sitio forma asociaciones mucho más fuertes. Atrae el ADN hacia el surco profundo de su dominio de unión al ADN . Esto da como resultado una deformación significativa de la estructura terciaria del ADN y se logra con superficies ricas en residuos básicos (cargados positivamente). Participa en una extensa interacción electrostática con el ADN. [7]
Algunas nucleasas implicadas en la reparación del ADN exhiben una especificidad de secuencia parcial. Sin embargo, la mayoría son inespecíficos y, en cambio, reconocen anomalías estructurales producidas en la columna vertebral del ADN por desajustes de pares de bases . [7]
Para obtener más información, consulte endonucleasa del colgajo .
Hay más de 900 enzimas de restricción, algunas de secuencia específica y otras no, que se han aislado de más de 230 cepas de bacterias desde el descubrimiento inicial de Hind II. Estas enzimas de restricción generalmente tienen nombres que reflejan su origen: la primera letra del nombre proviene del género y las dos segundas letras provienen de la especie de célula procariótica de la que fueron aisladas. Por ejemplo, Eco RI proviene de la bacteria Escherichia coli RY13, mientras que HindII proviene de la cepa Rd de Haemophilus influenzae . Los números que siguen a los nombres de las nucleasas indican el orden en que se aislaron las enzimas de cepas individuales de bacterias: Eco RI , Eco RII .
Una endonucleasa de restricción funciona "escaneando" la longitud de una molécula de ADN. Una vez que encuentre su secuencia de reconocimiento específica particular, se unirá a la molécula de ADN y realizará un corte en cada una de las dos cadenas principales de azúcar-fosfato. Las posiciones de estos dos cortes, tanto entre sí como con la secuencia de reconocimiento misma, están determinadas por la identidad de la endonucleasa de restricción. Diferentes endonucleasas producen diferentes conjuntos de cortes, pero una endonucleasa siempre cortará una secuencia de bases particular de la misma manera, sin importar sobre qué molécula de ADN esté actuando. Una vez realizados los cortes, la molécula de ADN se romperá en fragmentos.
No todas las endonucleasas de restricción cortan simétricamente y dejan extremos romos como Hind II descrito anteriormente. Muchas endonucleasas escinden las cadenas principales del ADN en posiciones que no están directamente opuestas entre sí, creando salientes. Por ejemplo, la nucleasa Eco RI tiene la secuencia de reconocimiento 5'—GAATTC—3'.
Cuando la enzima encuentra esta secuencia, escinde cada cadena principal entre los residuos de base G y A más cercanos. Una vez que se han realizado los cortes, los fragmentos resultantes se mantienen unidos sólo por los enlaces de hidrógeno relativamente débiles que mantienen las bases complementarias entre sí. La debilidad de estos enlaces permite que los fragmentos de ADN se separen entre sí. Cada fragmento resultante tiene un extremo 5' que sobresale compuesto de bases no apareadas. Otras enzimas crean cortes en la columna vertebral del ADN que dan como resultado extremos 3' que sobresalen. Los extremos que sobresalen (tanto 3' como 5') a veces se denominan " extremos pegajosos " porque tienden a unirse con secuencias complementarias de bases. En otras palabras, si una longitud de bases no apareada 5'—AATT—3'se encuentra con otra longitud no apareada en la secuencia, 3'—TTAA—5'se unirán entre sí: son "pegajosas" entre sí. Luego se utiliza la enzima ligasa para unir las cadenas principales de fosfato de las dos moléculas. El origen celular, o incluso el origen específico, de los extremos pegajosos no afecta a su pegajosidad. Cualquier par de secuencias complementarias tenderá a unirse, incluso si una de las secuencias proviene de un fragmento de ADN humano y la otra de un fragmento de ADN bacteriano. De hecho, es esta cualidad de pegajosidad la que permite la producción de moléculas de ADN recombinante, moléculas compuestas de ADN de diferentes fuentes, y que ha dado origen a la tecnología de ingeniería genética .
Dado que todas las células dependen del ADN como medio de información genética, el control de la calidad genética es una función esencial de todos los organismos. La replicación del ADN es un proceso propenso a errores y las propias moléculas de ADN son vulnerables a la modificación por muchos factores estresantes metabólicos y ambientales. Los ejemplos ubicuos incluyen especies reactivas de oxígeno , radiación ultravioleta cercana y radiación ionizante . Muchas nucleasas participan en la reparación del ADN reconociendo los sitios dañados y escindiéndolos del ADN circundante. Estas enzimas funcionan de forma independiente o en complejos . La mayoría de las nucleasas implicadas en la reparación del ADN no son específicas de secuencia. Reconocen los sitios de daño mediante la deformación de la estructura secundaria del ADN bicatenario (ADNbc). [5]
Durante la replicación del ADN , las ADN polimerasas alargan nuevas hebras de ADN contra hebras plantilla complementarias. La mayoría de las ADN polimerasas comprenden dos dominios enzimáticos diferentes : una polimerasa y una exonucleasa correctora . La polimerasa alarga la nueva cadena en la dirección 5' → 3'. La exonucleasa elimina los nucleótidos erróneos de la misma cadena en la dirección 3' → 5'. Esta actividad exonucleasa es esencial para la capacidad de corrección de una ADN polimerasa. Las deleciones que inactivan o eliminan estas nucleasas aumentan las tasas de mutación y mortalidad en los microbios afectados y el cáncer en ratones. [8]
Muchas formas de daño al ADN detienen la progresión de la bifurcación de replicación , lo que hace que las ADN polimerasas y la maquinaria asociada abandonen la bifurcación. Luego debe ser procesado por proteínas específicas de la horquilla. El más notable es MUS81 . Las deleciones que provocan daños en la sensibilidad a los rayos UV o la metilación en la levadura , además de defectos meióticos. [5]
Una tarea omnipresente en las células es la eliminación de los cebadores de ARN del fragmento de Okazaki de la replicación. La mayoría de estos cebadores se escinden de la cadena retardada de ADN recién sintetizada mediante endonucleasas de la familia RNasa H. En eucariotas y en arqueas , la endonucleasa del colgajo FEN1 también participa en el procesamiento de los fragmentos de Okazaki. [5]
La reparación de errores de coincidencia del ADN en cualquier organismo determinado se efectúa mediante un conjunto de endonucleasas específicas de errores de coincidencia. En procariotas, esta función la desempeñan principalmente MutSLH y proteínas asociadas a la reparación de parches muy cortos (reparación de VSP).
El sistema MutSLH (que comprende MutS , MutL y MutH) corrige mutaciones puntuales y pequeños giros . MutS reconoce y se une a los desajustes, donde recluta a MutL y MutH. MutL media la interacción entre MutS y MutH y mejora la actividad endonucleásica de este último. MutH reconoce 5'—GATC—3'sitios hemimetilados y se escinde junto a Gla cadena no metilada (la cadena sintetizada más recientemente).
La reparación de VSP es iniciada por la endonucleasa Vsr. Corrige un T/Gdesajuste específico causado por la desaminación espontánea de citosinas metiladas a timinas. Vsr reconoce la secuencia , donde corta la cadena de ADN en el lado 5' de la timina no coincidente (subrayada en la secuencia anterior). Luego , una de las exonucleasas RecJ, ExoVII o ExoI degrada el sitio antes de que la ADN polimerasa resintetice el espacio en la cadena. [5]5'—CTWGG—3'
La formación del sitio AP es una ocurrencia común en el dsDNA. Es el resultado de la hidrólisis espontánea y la actividad de las ADN glicosilasas como paso intermedio en la reparación por escisión de bases . Estos sitios AP son eliminados por endonucleasas AP , que provocan roturas de una sola cadena alrededor del sitio. [5]
La reparación por escisión de nucleótidos , que no debe confundirse con la reparación por escisión de bases, implica la eliminación y sustitución de nucleótidos dañados. Los casos de entrecruzamiento , aductos y lesiones (generadas por luz ultravioleta o especies reactivas de oxígeno ) pueden desencadenar esta vía de reparación. Se eliminan tramos cortos de ADN monocatenario que contienen dicho nucleótido dañado del ADN dúplex mediante endonucleasas separadas que efectúan mellas aguas arriba y aguas abajo del daño. Las deleciones o mutaciones que afectan a estas nucleasas provocan una mayor sensibilidad al daño ultravioleta y a la carcinogénesis. Estas anomalías pueden incluso afectar el desarrollo neuronal.
En bacterias, ambos cortes son ejecutados por el complejo UvrB-UvrC . En la levadura en ciernes, Rad2 y el complejo Rad1-Rad10 realizan los cortes 5' y 3', respectivamente. En los mamíferos, los homólogos XPG y XPF - ERCC1 afectan las mismas mellas respectivas. [9]
En las células se producen regularmente roturas de doble cadena , tanto intencionadas como no intencionadas. Las roturas involuntarias se generan comúnmente por radiación ionizante , diversos agentes químicos exógenos y endógenos y horquillas de replicación detenidas. Las roturas intencionales se generan como intermediarios en la meiosis y la recombinación V(D)J , que se reparan principalmente mediante recombinación homóloga y unión de extremos no homólogos . Ambos casos requieren que las nucleasas procesen los extremos de las roturas de doble cadena antes de que pueda tener lugar la reparación. Una de esas nucleasas es Mre11 formando un complejo con Rad50 . Las mutaciones de Mre11 pueden precipitar un trastorno similar a la ataxia-telangiectasia . [9]
La recombinación V(D)J implica abrir estructuras de bucles de tallo asociadas con roturas de doble hebra y posteriormente unir ambos extremos. En esta reacción participa el complejo Artemis-DNAPK cs . Aunque Artemisa exhibe actividad exonucleasa de ADN ss 5 '→ 3' cuando está sola, su complejación con ADN-PK cs permite el procesamiento endonucleásico de los bucles del tallo. Los defectos de cualquiera de las proteínas confieren una inmunodeficiencia grave. [9]
La recombinación homóloga, por otro lado, implica dos dúplex de ADN homólogos conectados por bucles D o uniones Holliday . En las bacterias, las endonucleasas como RuvC resuelven las uniones de Holliday en dos ADNbc separados escindiendo las uniones en dos sitios simétricos cerca del centro de la unión. En eucariotas, FEN1 , XPF - ERCC1 y MUS81 escinden los bucles D, y Cce1 / Ydc2 procesa las uniones Holliday en las mitocondrias. [9]
La frecuencia con la que una nucleasa particular cortará una molécula de ADN determinada depende de la complejidad del ADN y de la longitud de la secuencia de reconocimiento de la nucleasa; Debido a la probabilidad estadística de encontrar las bases en un orden particular por casualidad, una secuencia de reconocimiento más larga dará como resultado una digestión menos frecuente. Por ejemplo, se predice que una determinada secuencia de cuatro bases (correspondiente al sitio de reconocimiento de una nucleasa hipotética) ocurrirá cada 256 pares de bases en promedio (donde 4^4=256), pero se esperaría cualquier secuencia de seis bases. ocurrir una vez cada 4.096 pares de bases en promedio (4 ^ 6 = 4096).
Una familia única de nucleasas son las meganucleasas , que se caracterizan por tener secuencias de reconocimiento más grandes y, por lo tanto, menos comunes, que constan de 12 a 40 pares de bases. Estas nucleasas son particularmente útiles para aplicaciones de ingeniería genética y de ingeniería genómica en organismos complejos como plantas y mamíferos, donde genomas típicamente más grandes (que suman miles de millones de pares de bases) darían como resultado una digestión frecuente y nociva de un sitio específico utilizando nucleasas tradicionales.
