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Endonucleasa AP

Diagrama de cinta de APE1. PDB = 1de9. [1]

La endonucleasa apurínica/apirimidínica ( AP ) es una enzima que participa en la vía de reparación por escisión de bases del ADN (BER). Su función principal en la reparación de nucleótidos dañados o no coincidentes en el ADN es crear una muesca en la cadena principal de fosfodiéster del sitio AP que se crea cuando la ADN glicosilasa elimina la base dañada.

Existen cuatro tipos de endonucleasas AP que se han clasificado según su mecanismo y sitio de incisión. Las endonucleasas AP de clase I ( EC 4.2.99.18) escinden el ADN en los sitios AP de 3' a través de un mecanismo de β-liasa, dejando un aldehído insaturado, denominado residuo 3'-(4-hidroxi-5-fosfo-2-pentenal), y un 5'-fosfato. Las endonucleasas AP de clase II cortan el ADN en los sitios AP de 5' a través de un mecanismo hidrolítico, dejando un residuo 3'-hidroxilo y un residuo 5'-desoxirribosa fosfato. [2] Las endonucleasas AP de clase III y clase IV también escinden el ADN en los grupos fosfato 3' y 5' al sitio sin base, pero generan un 3'-fosfato y un 5'-OH. [3]

Los seres humanos tienen dos endonucleasas AP, APE1 y APE2 . APE1 exhibe una actividad AP-endonucleasa robusta, que representa >95% de la actividad celular total, y se considera que APE1 es la principal endonucleasa AP en las células humanas. [4] La endonucleasa AP humana (APE1), como la mayoría de las endonucleasas AP, es de clase II y requiere un Mg 2+ en su sitio activo para llevar a cabo su función en la reparación por escisión de bases. El homólogo de levadura de esta enzima es APN1. [5]

La endonucleasa AP 2 humana (APE2), como la mayoría de las endonucleasas AP, también es de clase II. La actividad exonucleasa de APE2 depende en gran medida de los iones metálicos. Sin embargo, APE2 fue más de 5 veces más activa en presencia de iones de manganeso que de magnesio. [4] Los dominios conservados involucrados en la actividad catalítica se encuentran en la parte N-terminal tanto de APE1 como de APE2. Además, la proteína APE2 tiene una extensión C-terminal, que no está presente en APE1, pero que también se puede encontrar en homólogos de APE2 humana, como las proteínas APN2 de S. cerevisiae y S. pombe . [4]

Estructura de APE1

Los residuos positivos en la superficie de la proteína APE1 (en azul) anclan y doblan el ADN a través de interacciones con los grupos fosfato negativos del ADN. PDB 1de9. [1]
Los enlaces de hidrógeno entre los residuos de aminoácidos clave ayudan a estabilizar la estructura del sitio activo. Además, un residuo con carga negativa (Glu 96) ayuda a mantener el Mg2+ también necesario para estabilizar el sitio AP en su lugar PDB 1de9. [1]

APE1 contiene varios residuos de aminoácidos que le permiten reaccionar selectivamente con los sitios AP. Tres residuos de APE1 ( Arg 73, Ala 74 y Lys 78) entran en contacto con tres fosfatos de ADN consecutivos en la cadena opuesta a la que contiene el sitio AP, mientras que Tyr 128 y Gly 127 abarcan y ensanchan el surco menor, anclando el ADN para el enroscamiento extremo causado por la interacción entre los residuos positivos que se encuentran en cuatro bucles y una hélice α y los grupos fosfato negativos que se encuentran en la estructura fosfodiéster del ADN.

Esta torcedura extrema fuerza la porción sin base del ADN hacia el sitio activo de APE1 . Este sitio activo está rodeado por Phe 266, Trp 280 y Leu 282, que se amontonan firmemente con el lado hidrofóbico del sitio AP, discriminando los sitios que sí tienen bases. El sitio AP se estabiliza luego aún más a través de la unión de hidrógeno del grupo fosfato 5' al sitio AP con Asn 174, Asn212, His 309 y el ion Mg 2+ mientras que su pareja de base huérfana se estabiliza a través de la unión de hidrógeno con Met 270. El grupo fosfato 3' al sitio AP se estabiliza a través de la unión de hidrógeno a Arg 177. Mientras tanto, un Asp 210 en el sitio activo, que se vuelve más reactivo debido al aumento de su pKa ( o el logaritmo negativo de la constante de disociación ácida ) causado a través de su estabilización a través de su unión de hidrógeno entre Asn68 y Asn212, activa el nucleófilo que ataca y escinde la cadena principal de fosfodiéster y probablemente da como resultado la actividad máxima observada de APE1 a un pH de 7,5. [1]

Mecanismo

La enzima APE1 crea una muesca en la cadena principal del fosfodiéster en un sitio abásico (sin base) a través de un mecanismo simple de sustitución de acilo. Primero, el residuo Asp210 en el sitio activo desprotona una molécula de agua, que luego puede realizar un ataque nucleofílico en el grupo fosfato ubicado 5' al sitio AP. A continuación, los electrones de uno de los átomos de oxígeno en el grupo fosfato se mueven hacia abajo, lo que desencadena uno de los otros oxígenos para crear un grupo fosfato 5' libre en el sitio AP y un 3'-OH libre en el nucleótido normal, ambos estabilizados por el ion Mg 2+ . [1]

Inhibición de APE1

Lucantón

Los inhibidores conocidos de APE1 incluyen el ácido 7-nitroindol-2-carboxílico (NCA) y la lucantona . [6] Ambas estructuras poseen anillos unidos a cadenas cortas, que parecen similares al anillo de azúcar desoxirribosa sin una base unida y un enlace fosfodiéster en el ADN. Además, ambos contienen muchos aceptores de enlaces de hidrógeno que pueden interactuar con los donantes de enlaces de hidrógeno en el sitio activo de APE1, lo que hace que estos inhibidores se adhieran al sitio activo y eviten que la enzima catalice otras reacciones.

APE1 como diana quimiopreventiva

Debido a que APE1 cumple una función esencial en la vía de reparación por escisión de bases del ADN, se ha convertido en un objetivo para los investigadores que buscan medios para evitar que las células cancerosas sobrevivan a la quimioterapia. APE1 no solo es necesario por sí mismo para crear la muesca en la estructura del ADN para que las enzimas involucradas más adelante en la vía BER puedan reconocer el sitio AP, sino que también tiene una función redox que ayuda a activar otras enzimas involucradas en la reparación del ADN. Como tal, la eliminación de APE1 podría conducir a la sensibilidad de las células tumorales, evitando así que las células cancerosas persistan después de la quimioterapia. [7]

Actividad de la enzima APE2

APE2 tiene una actividad endonucleasa AP mucho más débil que APE1, pero su actividad exonucleasa 3'-5' es fuerte en comparación con APE1 [8] y tiene una actividad 3'-fosfodiesterasa bastante fuerte. [4]

La actividad de la exonucleasa 3' –5' de APE2 tiene la capacidad de hidrolizar ADN dúplex de extremos romos, dúplex parciales de ADN con un extremo 3' hundido o un único nucleótido que contiene ADN heterodúplex. La actividad de la 3'-fosfodiesterasa de APE2 puede eliminar extremos 3' modificados, como el 3'-fosfoglicolato, así como nucleótidos no coincidentes del extremo 3' del cebador del ADN. [4]

APE2 es necesario para la respuesta al daño del ADN de ATR-Chk1 después del estrés oxidativo.

Referencias

Las imágenes de gráficos moleculares se produjeron utilizando el paquete UCSF Chimera del Recurso para Biocomputación, Visualización e Informática de la Universidad de California, San Francisco (con el apoyo de NIH P41 RR-01081). [9]

  1. ^ abcde Clifford D. Mol; Tahide Izumi; Sankar Mitra; John A. Tainer (2000). "Las estructuras y mutantes ligadas al ADN revelan una unión básica al ADN mediante la reparación y coordinación del ADN por APE1". Nature . 403 (6768): 451–456. doi :10.1038/35000249. PMID  10667800. S2CID  4373743.
  2. ^ Levin, Joshua D; Demple, Bruce (1990). "Análisis de endonucleasas apurínicas/apirimidínicas de clase II (hidrolíticas) y clase I (beta-liasa) con un sustrato de ADN sintético". Nucleic Acids Research . 18 (17): 5069–75. doi :10.1093/nar/18.17.5069. PMC 332125 . PMID  1698278. 
  3. ^ Gary M. Myles; Aziz Sancar (1989). "Reparación del ADN". Investigación química en toxicología . 2 (4): 197–226. doi :10.1021/tx00010a001. PMID  2519777.
  4. ^ abcde Burkovics P, Szukacsov V, Unk I, Haracska L (2006). "La proteína Ape2 humana tiene una actividad exonucleasa 3'-5' que actúa preferentemente sobre pares de bases no coincidentes". Nucleic Acids Res . 34 (9): 2508–15. doi :10.1093/nar/gkl259. PMC 1459411 . PMID  16687656. 
  5. ^ George W. Teebor; Dina R. Marensein; David M. Wilson III (2004). "La endonucleasa AP humana (APE1) demuestra actividad endonucleolítica contra sitios AP en ADN monocatenario". Reparación del ADN . 3 (5): 527–533. doi :10.1016/j.dnarep.2004.01.010. PMID  15084314.
  6. ^ Mark R. Kelley; Melissa L. Fishel (2007). "La proteína reparadora por escisión de bases de ADN Ape1/Ref-1 como objetivo terapéutico y quimiopreventivo". Aspectos moleculares de la medicina . 28 (3–4): 375–395. doi :10.1016/j.mam.2007.04.005. PMID  17560642.
  7. ^ Mark R. Kelley; Meihua Luo; Sarah Delaphlane; Aihua Jiang; April Reed; Ying He; Melissa Fishel; Rodney L. Nyland II; Richard F. Broch; Xizoxi Qiao; Millie M. Georgiadis (2008). "Papel de la proteína multifuncional de reparación del ADN y señalización redox Ape1/Ref-1 en células cancerosas y endoteliales: inhibición de la función redox de Ape1 por moléculas pequeñas". Antioxidantes y señalización redox . 10 (11): 1–12. doi :10.1089/ars.2008.2120. PMC 2587278 . PMID  18627350. 
  8. ^ Stavnezer J, Linehan EK, Thompson MR, Habboub G, Ucher AJ, Kadungure T, Tsuchimoto D, Nakabeppu Y, Schrader CE (2014). "La expresión diferencial de APE1 y APE2 en centros germinales promueve la reparación propensa a errores y las mutaciones A:T durante la hipermutación somática". Proc. Natl. Sci. USA . 111 (25): 9217–22. doi : 10.1073/pnas.1405590111 . PMC 4078814 . PMID  24927551. 
  9. ^ EF Pettersen; TD Goddard; CC Huang; GS Couch; DM Greenblat; EC Meng; TE Ferrin (2004). "UCSF Chimera - Un sistema de visualización para la investigación y el análisis exploratorios" (PDF) . J. Comput. Chem . 25 (13): 1605–1612. doi :10.1002/jcc.20084. PMID  15264254. S2CID  8747218.

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