El ensayo de protección de nucleasas es una técnica de laboratorio utilizada en bioquímica y genética para identificar moléculas de ARN individuales en una muestra de ARN heterogénea extraída de células . La técnica puede identificar una o más moléculas de ARN de secuencia conocida incluso a baja concentración total . El ARN extraído primero se mezcla con sondas de ARN o ADN antisentido que son complementarias a la secuencia o secuencias de interés y las hebras complementarias se hibridan para formar ARN bicatenario (o un híbrido de ADN-ARN). Luego, la mezcla se expone a ribonucleasas que escinden específicamente solo el ARN monocatenario pero no tienen actividad contra el ARN bicatenario. Cuando la reacción se completa, las regiones de ARN susceptibles se degradan a oligómeros muy cortos o a nucleótidos individuales ; los fragmentos de ARN supervivientes son aquellos que eran complementarios a la hebra antisentido añadida y, por tanto, contenían la secuencia de interés.
Las sondas se preparan clonando parte del gen de interés en un vector bajo el control de cualquiera de los siguientes promotores, SP6, T7 o T3. Estos promotores son reconocidos por las ARN polimerasas dependientes de ADN caracterizadas originalmente a partir de bacteriófagos. Las sondas producidas son radiactivas, ya que se preparan mediante transcripción in vitro utilizando UTP radiactivos. El ADN o ARN no complementado se escinde mediante nucleasas. Cuando la sonda es una molécula de ADN, se utiliza la nucleasa S1 ; cuando la sonda es ARN, se puede utilizar cualquier ribonucleasa específica de cadena sencilla. De este modo, el complemento sonda-ARNm superviviente se detecta simplemente mediante autorradiografía.
Los ensayos de protección de nucleasas se utilizan para mapear intrones y extremos 5' y 3' de regiones de genes transcritos. Se pueden obtener resultados cuantitativos con respecto a la cantidad de ARN objetivo presente en el extracto celular original: si el objetivo es un ARN mensajero , esto puede indicar el nivel de transcripción del gen en la célula.
También se utilizan para detectar la presencia de ARN bicatenario, cuya presencia podría significar interferencia de ARN .
El Northern blotting es una técnica de laboratorio que produce información similar. Es más lenta y menos cuantitativa, pero también produce información precisa sobre el tamaño del ARN diana. Los productos del ensayo de protección de nucleasas están limitados al tamaño de las sondas iniciales debido a la destrucción del ARN no hibridado durante el paso de digestión con nucleasas.