Clase de enzimas
La nucleasa de Serratia marcescens ( EC 3.1.30.2, endonucleasa ( Serratia marcescens ), nucleasa de cebada, nucleasa vegetal I, endonucleasa nucleada) es una enzima . [1] [2] [3] [4] Esta enzima cataliza la siguiente reacción química
- Escisión endonucleolítica para obtener productos finales 5'-fosfomononucleótido y 5'-fosfooligonucleótido
Hidroliza el ADN o ARN de cadena simple o doble. Es un representante de la familia de endonucleasas no específicas de ADN/ARN .
Está disponible comercialmente.
Características
La nucleasa Serratia se purificó por primera vez a partir de su fuente nativa en 1969. [5] Se clonó en 1987 y se demostró que consiste en un precursor de proteína 266 , [6] que se escinde y secreta como una nucleasa activa de 245 aminoácidos. [7] Su forma activa en solución es un homodímero. [8] Tiene dos enlaces disulfuro, el primero entre la cisteína 30 y 34 y el segundo entre la cisteína 222 y 264. [7] La reducción de estos disulfuros o la mutagénesis dirigida al sitio de sus residuos a serina, específicamente el primero, conduce a una gran pérdida de actividad de la nucleasa, [8] y una pérdida de la capacidad de recuperar reversiblemente la actividad después de inactivar los tratamientos térmicos de 40-60 °C. [7] Tiene una eficiencia catalítica mucho mayor que otras nucleasas, aproximadamente 4 veces mayor que la nucleasa estafilocócica y aproximadamente 34 veces mayor que la DNasa I pancreática bovina . [8] La enzima escinde ADN y ARN monocatenarios o bicatenarios con velocidades similares, siempre que el ADN o ARN sustrato contenga no menos de 5 nucleótidos (o pares de bases). [8] El magnesio (II) (Mg 2+ ) es un cofactor esencial para su actividad nucleasa. [8] La nucleasa Serratia se activa con hasta 4 M de urea . [9] Con 5 M de urea, la actividad inicial disminuye desde su pico aunque todavía está por encima de su línea base, y la enzima se inhibe significativamente después de 60 minutos. Con 6 M de urea, la actividad nucleasa está por debajo de la línea base y se inactiva casi por completo en 60 minutos. A 7 M, la nucleasa se inactiva prácticamente por completo en 15 minutos, pero puede producirse una degradación significativa y viable de los ácidos nucleicos antes de que se inactive la nucleasa. [9] La urea a 8 M provoca una inactivación completa de la enzima en 5 minutos. [7]
Condiciones óptimas[9]
1="Óptimo" es la condición en la que la nucleasa Serratia conserva >90 % de su actividad.
2="Efectivo" es la condición en la que la nucleasa de Serratia retiene >15 % de su actividad.
Condiciones inhibitorias
Se conocen algunas condiciones inhibitorias: [9]
- >300 mM de cationes monovalentes ( Na + , K + , etc.)
- >100 mM de fosfato
- >100 mM de sulfato de amonio
- >100 mM de clorhidrato de guanidina
- >2 mM de EDTA
- >4 mM de EGTA
- >0,4 % p/v Triton X-100 (sin efecto por debajo del 0,4 %, ligera activación por encima del 0,4 %)
- >0,4 % p/v de desoxicolato de sodio (70 % de actividad al 0,4 %, inactivación constante por debajo y por encima del 0,4 %)
- >0,1 % p/v SDS (la cinética de inactivación permite que la nucleasa Serratia aún degrade algunos ácidos nucleicos antes de la inactivación)
Uso en biotecnología
Dada su alta actividad, alta estabilidad e inactivación reversible a tratamientos térmicos, mejora de la velocidad o de otra manera compatibilidad con algunos reactivos desnaturalizantes como la urea , la nucleasa Serratia fue reconocida tempranamente por tener potencial industrial y comercial. Una patente que cubría la expresión recombinante de la nucleasa Serratia en E. coli fue presentada por Benzon Pharma en 1986, concedida en 1992 y expiró en 2006. [10] Esta nucleasa Serratia recombinante fue comercializada como Benzonase, y todavía está disponible en y es una marca registrada de Merck KGaA . [11] Cabe destacar que la secuencia patentada [10] [12] para Benzonase es ligeramente diferente (1 sustitución de aminoácido) de la nucleasa Serratia marcescens que fue clonada públicamente. [13]
Como la patente de la benzonasa ya ha expirado y, de hecho, nunca fue presentada ni concedida en los Estados Unidos, ahora hay disponibles varias alternativas comerciales para la nucleasa de Serratia marcescens producida de forma recombinante:
- Basemuncher, de Westburg Life Sciences [14]
- Benzonucleasa, de Tinzyme [15]
- Benz-Neburasa, de GenScript [16]
- Descontaminación, de AG Scientific [17]
- Denarasa, de c-LEcta [18]
- Dr. Nuclease, de Syd Labs [19]
- Nucleasa GENIUS, de ACROBiosystems [20]
- Nucleasa universal Pierce , de Thermo Fisher Scientific [21]
- TurboNucleasa, de Accelagen [22]
(Un notable no productor actual es New England Biolabs ) [23]
Véase también
Referencias
- ^ Mikulski AJ, Laskowski M (octubre de 1970). "Nucleasa I de frijol mungo. 3. Procedimiento de purificación y actividad de la monofosfatasa (3') omega". The Journal of Biological Chemistry . 245 (19): 5026–5031. doi : 10.1016/S0021-9258(18)62813-3 . PMID 4319109.
- ^ Stevens A, Hilmoe RJ (1960). "Estudios sobre una nucleasa de Azotobacter agilis. I. Aislamiento y modo de acción". Journal of Biological Chemistry . 235 (10): 3016–3022. doi : 10.1016/S0021-9258(18)64581-8 .
- ^ Stevens A, Hilmoe RJ (1960). "Estudios sobre una nucleasa de Azotobacter agilis. II. Hidrólisis de ácidos ribonucleicos y desoxirribonucleicos". Journal of Biological Chemistry . 235 (10): 3023–3027. doi : 10.1016/S0021-9258(18)64582-X .
- ^ Wechter WJ, Mikulski AJ, Laskowski M (febrero de 1968). "Gradación de la especificidad con respecto al azúcar entre las nucleasas". Biochemical and Biophysical Research Communications . 30 (3): 318–322. doi :10.1016/0006-291x(68)90453-1. PMID 4296679.
- ^ Nestle M, Roberts WK (octubre de 1969). "Una nucleasa extracelular de Serratia marcescens. I. Purificación y algunas propiedades de la enzima". The Journal of Biological Chemistry . 244 (19). Elsevier BV: 5213–5218. doi : 10.1016/s0021-9258(18)63648-8 . PMID 4899013.
- ^ Ball TK, Saurugger PN, Benedik MJ (1987). "El gen de la nucleasa extracelular de Serratia marcescens y su secreción por Escherichia coli". Gene . 57 (2–3). Elsevier BV: 183–192. doi :10.1016/0378-1119(87)90121-1. PMID 3319779.
- ^ abcd Biedermann K, Jepsen PK, Riise E, Svendsen I (1989). "Purificación y caracterización de una nucleasa de Serratia marcescens producida por Escherichia coli". Carlsberg Research Communications . 54 (1). Springer Science and Business Media LLC: 17–27. doi : 10.1007/bf02910469 . PMID 2665765. S2CID 12831178.
- ^ abcde Benedik MJ, Strych U (agosto de 1998). "Serratia marcescens y su nucleasa extracelular". FEMS Microbiology Letters . 165 (1). Oxford University Press (OUP): 1–13. doi : 10.1111/j.1574-6968.1998.tb13120.x . PMID 9711834.
- ^ abcd "Nucleasa Benzonase®: eliminación eficaz de ácidos nucleicos y reducción de la viscosidad de soluciones proteicas" (PDF) . EMD Biosciences . SigmaAldrich . Consultado el 29 de abril de 2023 .
- ^ ab EP 0229866A1, Molin S, Givskov M, Riise E, "Enzimas bacterianas y método para su producción", expedida el 9 de diciembre de 1992, asignada a Benzon Pharma AS y Takeda Pharma AS
- ^ "Nucleasa Benzonase® HC, pureza > 99 % - 71206". MilliporeSigma . Consultado el 29 de abril de 2023 .
- ^ "UniProt". UniProt . Consultado el 29 de abril de 2023 .
- ^ "UniProt". UniProt . Consultado el 29 de abril de 2023 .
- ^ "Basemuncher Benzonase". Westburg . Consultado el 29 de abril de 2023 .
- ^ "Benzo Nuclease". Tinzyme Ltd – Enzimas, dNTP y rNTP . 2021-12-24 . Consultado el 2023-04-29 .
- ^ "Benz-Neburase™, His". GenScript . 2021-08-12 . Consultado el 2023-04-29 .
- ^ "B-1400-5KU - Decontaminase™, 5 KU". AG Scientific . 13 de diciembre de 2022 . Consultado el 29 de abril de 2023 .
- ^ "Denarase". c-LEcta . 2022-12-13 . Consultado el 2023-04-29 .
- ^ "Alternativa a la nucleasa Benzonase, alternativa a la nucleasa DENARASE". Syd Labs . 2020-05-01 . Consultado el 2023-04-29 .
- ^ "GENIUS™Nuclease DMF Filed" (Archivado para la genómica genómica genómica genómica DMF). ACROBiosystems . Consultado el 29 de abril de 2023 .
- ^ "Nucleasa universal Pierce™ para lisis celular". Thermo Fisher Scientific . 2023-04-29 . Consultado el 2023-04-29 .
- ^ "TurboNuclease". Accelagen . 2023-04-29 . Consultado el 2023-04-29 .
- ^ Biolabs, Nueva Inglaterra. "Enzimas modificadoras de ADN y tecnologías de clonación: exonucleasas y endonucleasas no específicas". New England Biolabs . Consultado el 30 de abril de 2023 .
Enlaces externos
- Serratia+marcescens+nuclease en los encabezados de materias médicas (MeSH) de la Biblioteca Nacional de Medicina de EE. UU.
- Endonucleasa de Serratia marcescens en Protean Ltd., altamente activa
