Tras probar fortuna en diferentes oficios, Lee Strasberg comenzó a interpretar sus primeros papeles en colectivos independientes de teatro político.
En 1925 comenzó a trabajar como actor y director en el Theatre Guild, que abandonó al cabo de cinco años para fundar su propia compañía.
En 1931, fue uno de los fundadores del Group Theatre, una compañía que contó con la participación de Elia Kazan, John Garfield, Stella Adler, Sanford Meisner, Franchot Tone y Robert Lewis.
Bajo su tutela se cuentan actores como: Marlon Brando, Paul Newman, Al Pacino, Anne Bancroft, Montgomery Clift, Marilyn Monroe, Jane Fonda, James Dean, Dustin Hoffman, Eli Wallach, Geraldine Page, Eva Marie Saint, Robert De Niro, Jill Clayburgh, Jack Nicholson y Steve McQueen.
Probablemente su interpretación más famosa (y que le significó la nominación al Oscar) fue en la segunda parte de El padrino, donde encarnó a Hyman Roth, un mafioso judío jubilado que supervisaba desde Miami el crimen organizado de Cuba.